食品病原微生物学
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1.1 食品病原性细菌的分类

细菌的分类就是按每种细菌各自的特点,以亲缘关系分门别类,以不同的等级编排成系统。命名(nomenclature)是在分类的基础上,给予每种细菌一个科学名称。鉴定是分类的系统实验过程。分类、命名及鉴定统称为分类学。随着分子生物技术手段的不断进步,对细菌的分类在过去的十几年间增添了新的方法和手段,使细菌的分类更加系统和科学化,也改变了一些原来的分类菌群,产生了许多新的分类群。目前对细菌的分类包含如下方法:

① DNA同源性和DNA中(G+C)的含量;

② 23S rRNA,16S rRNA和5S rRNA序列的类似性; 

③ 寡核苷酸种类;

④ 菌体形态及生理生化特征或全可溶性蛋白的数值分类法;

⑤ 细胞壁成分分析;

⑥ 血清学反应(是细菌致病性的重要指标);

⑦ 细胞脂肪酸组成。

细菌分类等级为:界(Kingdom)、门(Division)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(species)。在两个等级之间可添加次要或更细的鉴别或分类单位,如亚门、亚纲、亚属、亚种等。科与属之间还可添加族(tribe)这一分类单位。一般分类单位所用的拉丁语(书写要斜体)字尾比较固定,常采用:

目       拉丁语字尾是-ales

亚目     拉丁语字尾是-ineae

科     拉丁语字尾是-aceae

亚科   拉丁语字尾是-oideae

族   拉丁语字尾是-eae

亚族 拉丁语字尾是-inae

群或组(group)不是正式的分类单位,是指具有某种共同特征的一群(组)不同个体,任何一级都可借用。种是最基本的分类单位,相近的种归为一属,相近的属归为一科,依次类推。种以下还有亚种、变种(varietas)、型(types)、株(strains)等。型是按细菌某些细微特征在种内区分,按区分方法的不同,又分为血清型、噬菌体型、细菌素型、生物型及毒素型等。株为来源不同的相同的种或型。

1.1.1 种(species)

是细菌分类中最基本的分类单位,是细菌进化的特定阶段。种代表一群在形态、生理特性和组成成分彼此十分相似或彼此性状差异微小的个体。同一个种的细菌由于环境条件的变化,在形态特征、生理特性方面发生了一些极微细的差异变化,但总的特征还是一致的。

1.1.2 变种(varietas or var.)

变种即同一菌种之间有一定差异的一群个体。一个菌种的某种特征出现了明显改变,与典型种的某一特性出现差异,而其余特征又完全符合,若这一变异特征能够稳定下去,这种变异的菌种称为典型种的变种。

1.1.3 亚种(又称小种)(subspecies)

科学家们将在实验室所获得的变异型称为亚种或小种。如E.coli野生型的一个品系K12,这个菌种不需要某种氨基酸的。通过实验室人工诱变,可以从K12中获得某种氨基酸的营养缺陷型,即出发株不需要该种氨基酸就能生长,而诱变株缺乏该种氨基酸不能生长,这就叫做K12的亚种。

1.1.4 型(types)

型被用于变种以下的细分。同一种内的细菌中有一些个别特征或特殊性状上不同,如抗原结构的差异,可将同种内的菌分成不同的血清型,对噬菌体或抗生素敏感的不同,可分成噬菌体或抗生素型。

1.1.5 菌株(strains)

指种内的单个或克隆的菌落培养物,自然分离到的每一个微生物单个菌落培养物都称为菌株或品系。

1.1.6 群(group)

微生物在进化过程中,由一个种变成另外一个种,其间要产生一系列过渡类型,所以自然界中有些微生物种类特征介于两种微生物之间,彼此之间难以区分开来,我们就把这两种微生物和介于他们之间的种类统称为一个“群”。

1.1.7 生理学与生物化学分类法

过去很长时间和现在都是以细菌的生理、生化特征作为分类的主要依据,包括细菌的形态、染色、细菌的特殊附属结构,这些特征是细菌最早和最基本的分类依据。如细菌的形态可分为球菌、杆菌、弧菌、螺菌等。根据染色特征可分为革兰氏阳性和阴性,而细菌的染色特征又与细菌胞壁的结构有关,根据细胞壁特性又将细菌分为厚壁细菌和薄壁细菌;细菌的芽孢、鞭毛的结构亦作为分类的依据。

细菌的生理生化项目很多,包括生长条件、色素观察、抵抗力的测定、糖类代谢、有机酸盐和氨盐利用试验、蛋白质和氨基酸代谢试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验及其他消化及水解试验等。特殊项目包括主要代谢途径试验,如能量代谢、糖代谢中间途径及丙酮酸代谢途径,终末代谢产物的测定等;测定细菌本身的成分如细胞壁化学组分、脂肪酸、磷酸类脂等;测定细菌的分解产物及细菌的致病性和毒力等。抗原结构分析可用免疫血清如凝集、沉淀、琼脂扩散、免疫电泳、荧光抗体及酶标记抗体等方法确定细菌的种或型,细菌的精确抗原分析对致病型细菌的鉴定是最准确的方法之一;用免疫化学方法测定某些细菌抗原的结构、末端单糖及核心多糖以确定细菌的群。

以生理生化学作为细菌分类被广泛采用的方法有两种,即传统分类法和数值分类法。

1.1.7.1 传统分类法

传统分类的原则是将生物的基本性质分为主要次要,然后按这个主次顺序一级一级分下去,直至最小区分。目前认为细菌细胞壁的结构特点作为最高一级的分类依据,如原核生物界分为四个菌门:薄壁菌门、厚壁菌门、疵壁菌门、柔膜菌门。按细胞形态、革兰氏染色特征、鞭毛及代谢特点等作为较高一级的分类依据,而科、属、种水平的分类主要依靠生化特性和抗原结构。

1.1.7.2 数值分类法

本法是在一系列细菌的基本特征不分主次,放在相同的地位上进行比较,测定其相似率,区分种群,并确定各种细菌的亲缘关系。一般选择100~200项生理生化指标,逐一进行比较,才有分类学意义。

1.1.7.3 生理生化分型和遗传学分型

多是作为种或种以上分类依据,如果要求细菌种内进一步细分,即分型,就需要做更细致的研究。由于目前并不是所有的细菌都作了基因组测定,因此,细菌的一些特殊性质的决定基因不是都清楚,还需要作其他鉴定来细分,可用抗原分型、噬菌体分型及细菌毒素分型。抗原分型是利用细菌细胞壁多糖不同,鞭毛蛋白的差异和荚膜多糖组成特点在同一种内进行分型;噬菌体对菌体具有严格的专一性,以这种高度专一性或特异性能够很好地区分相应的细菌;细菌素可根据受影响的菌体敏感性分型。近年来分析细菌细胞壁多糖分子和黏附分子的化学组成、细胞壁中脂肪酸的组成和细胞可溶性蛋白质电泳分析等手段对细菌进行分类,进展也很快,多数被以综合成快速鉴定仪器而获得普遍使用。

1.1.8 遗传学分类法

细菌生理生化特征均是由遗传基因所决定的,表型的差别是遗传物质在结构上差异的体现。遗传关系作细菌分类有如下优点:①可能给细菌的种有一个比较系统的概念;②根据遗传关系的分类比较稳定;③细菌根据遗传关系分类之后可设计出可靠的鉴定方案;④所得资料对于了解不同类别的细菌是如何发展起来的和如何按照它们原始亲缘关系排列是有用的。比较稳定的技术有如下几种。

1.1.8.1 DNA的(G+C)mol含量测定

DNA分子由四种不同碱基组成的核苷酸,四种碱基的总分子量为100,测定其中的鸟嘌呤和胞嘧啶的分子百分含量(G+C),或测定腺嘌呤和胸腺嘧啶的分子百分含量(A+T)能了解各种细菌DNA分子同源性程度。亲缘关系接近的细菌,它们的(G+C)mol含量相同或近似。一个菌种的(G+C)mol含量相当稳定。目前较常用加热变性法、浮力密度法测定(G+C)mol含量。

1.1.8.2 DNA-DNA相关度测定

亲缘相近的菌属,其DNA的(G+C)mol含量相同或近似;反之,DNA的(G+C)mol含量相同或近似的细菌,其亲缘关系却不一定相近。DNA-DNA相关度测定就是看细菌的核苷酸碱基排列顺序是否相同,相同程度如何,就要做两种细菌DNA相关度测定。将不同的菌株使DNA裂解变性,标记一种菌的DNA,再复性,测定两种菌的DNA分子的结合率。本菌的结合率为100%,种内结合率为60%~100%,组内结合率为80%~90%。

1.1.8.3 rRNA的碱基顺序

RNA分子是一条多核苷酸单链。嘌呤碱基及嘧啶与DNA分子相同;嘌呤包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、嘧啶包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)。RNA的碱基是由DNA转录过来的,具有完全对应关系。提取并分离细菌细胞内的16S rRNA,以T1核糖核酸酶消化,可获得细菌寡核苷酸上的碱基编码,作为细菌学分类的一种标记。由于广泛地使用16S rRNA序列相似法,新的食品传播的微生物分类群就是通过这种分类法与其他的信息相结合而创立出来,特点是简便快速。

1.1.8.4 核糖体蛋白的组成分析

用蔗糖密度梯度离心法分离30S和50S的核糖体蛋白的亚单位,再经羧甲基纤维素层析法,比较其中所含核糖体蛋白的种类及其含量,可将被鉴定菌株分为类群,并绘制系统发生图,其结果与DNA-DNA相关度测定的结果是基本符合的。

1.1.8.5 16S rDNA鉴定

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中,处于稳定状态。16S rDNA鉴定是指利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定,因为每种细菌的16S rDNA都是相对保守的。包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤,是一种快速获得细菌种属信息的方法。

1.1.9 微生物命名

微生物的名称有两种,一为俗名或代号,另一为学名,即国际名称。国际名称是按照瑞典生物学家林奈(Linnaeus)于1753年首先使用的双名法(属名在前,种名在后)来定名,由两个拉丁字或希腊字或者拉丁化了的其他文字组成。有时还在种名后附有命名者的姓,排除“同名异物”或“同物异名”之类的误解。属名是拉丁字的名称词,字首字母要大写,用以描述微生物的主要特征。种名用的是一个拉丁字形容词或名称所有格,用以描述次要特征,并要求斜体。但有时属名或种名也有用人名或地名来表示。在学名之后有时还要附命名人的姓和年代。如金黄色葡萄球菌的学名:Staphylococcus aureusRosenbach 1939。泛指某一属的微生物而不特定指某一具体种,或没有种名时,可在属名后面加sp.(species的单数)或spp.(复数)表示。如果当初所定的学名后来经人改过,则在学名后括号内注明首先发现该菌的人,然后将改正人的姓写在后面。