实验10　反式偶氮苯的光异构化及薄层色谱分离

【实验目的】

1.了解薄层色谱的基本原理。

2.掌握薄层色谱法的操作步骤和方法。

【实验原理】

见2.2.9节薄层色谱。

【实验装置】

薄层层析装置（见2.2.9节）。

【实验用品】

仪器：玻璃片，毛细管，展开槽（可用带塞的锥形瓶）。

试剂：A. 1%偶氮苯的四氯化碳溶液，B. 0.01%对二甲基偶氮苯的四氯化碳溶液，C. A与B的混合液，四氯化碳，氯仿，硅胶等。

【操作步骤】

1.薄层板的制备

薄层板制备的好坏，是实验成败的关键，薄层应尽可能牢固、均匀，厚度以0.25～1mm为宜。

铺层方法有平铺法和倾注法。本实验采用倾注法：称取一定量的硅胶G于50mL小烧杯中，加入0.5%的羧甲基纤维素钠清液（一般每克硅胶G需要加入3～4mL 0.5%的羧甲基纤维素钠清液；每克氧化铝G需要加入2mL 0.5%的羧甲基纤维素钠清液），用玻璃棒轻轻搅匀（注意不要剧烈搅拌，以防将气泡带入匀浆，影响薄层质量）。然后迅速将匀浆倾注在两块洗净、晾干的载玻片上。用食指和拇指拿住玻璃片两端，前后左右轻轻摇晃，使流动的匀浆均匀地铺在玻璃片上，且表面光洁平整。然后放在已校正平面的平板上阴干，干后放入烘箱加热活化，调节烘箱缓缓升温至110℃恒温30min，取出放在干燥器中备用。

2.点样

在离薄层板底端1～2cm处，用铅笔轻轻画出一条基线，在一块板上点A和C，另一块板上点B和C。点样时应选择管口平齐的玻璃毛细管，吸取少量样品液体，轻轻接触薄层板。如果一次点样不够，可等溶剂挥发后再点数次，但控制样品点的扩散直径不超过2mm，不同样品点间距大于1.5cm，样品点与玻板边缘距离大于5mm。

3.展开

以3∶2的四氯化碳、氯仿混合液为展开剂，倒入展开槽内（液层厚度0.5mm），饱和5～10min。将点好样品的两块薄层板放入缸内，点样一端在下（注意样品点必须在展开剂液面之上）。盖好缸盖，此时展开剂沿着薄层板上升，当展开剂前沿上升到距顶端1cm左右时取出薄层板。尽快用铅笔标出前沿位置，晾干。

本实验所用样品本身有颜色，故无需显色。

4. Rf值的计算

量出从原点到展开剂前沿以及到各色斑中心的距离。计算Rf值，并鉴别各色斑属于何种物质。

【注意事项】

1.要得到黏结较牢的薄层板，玻璃片一定要洗干净，一般先用肥皂洗净，自来水、蒸馏水冲洗，必要时用酒精擦洗，洗净后只拿切面。

2.薄层吸附色谱用的吸附剂和柱色谱用的一样，有氧化铝和硅胶等。硅胶G是由硅胶和作为黏合剂的煅石膏组成，使用时直接用0.5%的羧甲基纤维素钠清液调成匀浆。

3.薄层色谱展开剂和柱色谱相同，主要根据样品的极性、溶解度和吸附活性等因素综合考虑。溶剂的极性越大，则对化合物的洗脱力越大，即Rf值越大。如果发现样品的Rf值较大，可以考虑换极性小的溶剂，或在原来展开剂中加入适量极性较小的溶剂去展开。

【思考题】

1.样品斑点过大有何坏处？若将样品点浸入展开剂液面下面会有何结果？

2.在分离偶氮苯和对二甲基偶氮苯时，若增加展开剂中氯仿的比例，二者的Rf值有何变化？

2.2.10　柱色谱

柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂；后者以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。下面主要介绍柱上吸附色谱的分离方法。

图2-38为一般柱色谱装置，其内装有氧化铝或硅胶等吸附剂。液体样品从柱顶加入，流经吸附柱时，即被吸附在柱的上端。当加入的洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下移动，形成若干色带。继续洗脱时，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出。这样在连续洗脱过程中，不同组分即不同色带就能分别收集到，从而达到分离纯化的目的。若是无色物质，可用紫外线照射后所呈现的荧光来检查，或用溶剂洗脱时，分段收集，逐个加以鉴定（点板，Rf值相同的为同一组分），合并相同组分的洗脱液，脱洗得单一组分。

1.吸附剂

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、活性炭或纤维素粉等。选择吸附剂的首要条件是不能与被分离物或展开剂起化学反应。吸附能力与其颗粒大小有关。颗粒小，表面积大，吸附能力就强，但若太小则流速慢。色谱用的氧化铝可分为酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至悬浮液pH值为4～4.5，用于分离酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH值为9～10，用于分离生物碱、碳氢化合物等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。表2-9列出了氧化铝和硅胶的活性等级和含水量的关系。

吸附剂的用量一般为被分离物质量的20～50倍，有时甚至高达100倍以上。化合物的吸附能力与分子极性有关，分子极性越强，吸附能力越大。

2.溶剂

溶剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附剂活性等来考虑。先将待分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中，从柱顶流入柱中，然后依次增大溶剂的极性，将不同极性的化合物依次洗脱，分别收集，为了提高溶剂的洗脱能力，亦可用混合溶剂洗脱。常用洗脱剂的极性按下列次序递增：石油醚、环己烷、四氯化碳、甲苯、苯、 二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸等。

3.操作

根据被分离样品的量选择大小合适的色谱柱，柱高和直径之比一般为7.5∶1。先将色谱柱洗净，干燥后备用。装柱时先在柱底铺一层玻璃棉或脱脂棉，再铺一层约5mm厚的石英砂，然后将氧化铝（或硅胶粉）装入柱内，必须装填均匀，严格排除空气，吸附剂不能有裂缝。装填的方法有湿法和干法两种：湿法是先将溶剂装入柱内，再将氧化铝用极性小的溶剂调成糊状，慢慢倒入柱中，打开柱子下端活塞，让溶剂流出，使吸附剂渐渐下沉，必要时用木棒或试管夹轻轻敲击柱身，使装填紧密；干法是在柱上端放一漏斗，先将氧化铝均匀装入柱中，然后才加入极性小的溶剂至氧化铝全部润湿，或先将溶剂加入柱内约3/4处，随后在不断敲击下将氧化铝慢慢倒入柱中，使装填均匀（此时同样要打开柱子下端二通活塞）。装填完毕，在氧化铝顶部加一层约5mm厚的石英砂或一直径比柱内径略小的小圆滤纸，待溶剂流至砂面或滤纸表面时，加入要分离的物质溶液，等此溶液流至砂面或滤纸表面时，才能加入洗脱剂进行洗脱，整个洗脱过程都应用溶剂覆盖吸附剂。