实验11　胡萝卜素的柱色谱分离

【实验目的】

1.了解吸附色谱法的基本原理及应用。

2.掌握吸附色谱的基本操作技术。

【实验原理】

胡萝卜素存在于辣椒和胡萝卜等黄绿色植物中，因其在动物体内可转变成维生素A，故称为维生素A原。胡萝卜素可用酒精、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来，且能被氧化铝（Al2O3）所吸附。由于胡萝卜素与其他植物色素的化学结构不同，它们被氧化铝吸附的强度以及在有机溶剂中的溶解度不相同，故将提取液利用氧化铝分离，再用石油醚等冲洗色谱柱，即可分离成不同的色带。同植物其他色素比较，胡萝卜素吸附最差，跑在最前面，故最先被洗脱下来。

【实验装置】

柱色谱装置（见2.2.10节）。

【实验用品】

仪器：研钵，试管，量筒，吸管，分液漏斗，小烧杯，色谱柱，滴管，铁架台，蒸发皿，恒温水浴锅等。

试剂及材料：95%乙醇，石油醚，1%丙酮的石油醚（1∶100，体积比），Al2O3（固体），无水Na2SO4，三氯化锑/氯仿溶液（称取三氯化锑22g，加100mL氯仿溶解后，贮于棕色瓶中），新鲜红辣椒（或干红辣椒），棉花，滤纸等。

【实验内容】

1.提取

方案一：称取新鲜红辣椒12g左右（或干红辣椒2～3g），去籽剪碎后置研钵中研磨。加入95%乙醇4mL，研磨至提取液呈深红色，加入丙酮4mL继续研磨至成匀浆，加入蒸馏水20mL。混匀后，以四层纱布（或棉花）过滤，收集全部滤液至分液漏斗中，加入石油醚6mL，振荡数次后静置片刻。弃去下面的水层，再以蒸馏水20mL洗涤数次，直至水层透明为止，借以除去提取液中的乙醇。将橘黄色的石油醚层倒入干燥试管中，加少量Na2SO4 除去水分，用软木塞塞紧，以免石油醚挥发。

方案二：取干红辣椒皮2g，剪后放入研钵中，加95%乙醇4mL，研磨至提取液呈深红色，再加石油醚6mL研磨3～5min，此时，若石油醚挥发过多，可再加4mL左右，提取液颜色愈深，则表示提取的胡萝卜素愈多。将提取液先用纱布过滤，再置于分液漏斗中，用20mL蒸馏水洗涤数次，直至水层透明为止，借以除去提取液中的乙醇。然后将红色石油醚层倒入干燥试管中，加少量无水硫酸钠除去水分，用软木塞塞紧试管口，以防石油醚挥发。

2.装柱

取直径为1cm、长为16cm的色谱柱并垂直安装在铁架台上，在其底部放少量棉花，然后自柱的顶端沿管内壁缓缓加入石油醚-氧化铝悬浮液至柱顶部，待氧化铝在柱中沉积约10cm时，于其柱床上铺一张略小于色谱柱内径的圆形小滤纸（或棉花）（装柱要均匀，无断层，柱床表面要水平）。

3.色谱分离

用吸管取样品-石油醚提取液1mL，沿柱内壁缓缓加入（注意切勿破坏柱床面），待样品-石油醚提取液全部进入色谱柱时立即加入含1%丙酮-石油醚冲洗，使吸附在柱上端的物质逐渐展开成为不同的色带。仔细观察色带的位置、宽度与颜色，并绘图记录。跑在最前方的橘黄色带即为胡萝卜素，待该色素接近色谱柱下端时，用一试管接收此橘黄色液体，然后倒入蒸发皿内，于80℃水浴上蒸干，滴入三氯化锑氯仿溶液数滴，可见蓝色反应，借此鉴定胡萝卜素。

【注意事项】

1.红辣椒等一定要研磨彻底，以破坏植物细胞释放出胡萝卜素，实验中加入4mL丙酮有利于对胡萝卜素的提取，此法可分离得到5～6条色带，最前面的色素为橘红色的胡萝卜素，紧随其后的分别为番茄红素和叶黄素等。

2.吸附剂的活性和吸附剂的含水量有关，若先用高温处理（350～400℃烘烤3h），可除去水分，提高其吸附力，但市售的氧化铝一般不需要高温处理即可达到满意的分离效果。

3.装柱时，不能使氧化铝有裂缝和气泡，否则影响分离效果。氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的3/4，装好柱后柱上面覆一层滤纸，以保持柱上端顶部平整，若顶部不平，将产生不规则的色带。溶媒中丙酮可增强洗脱效果，但含量不宜过多，以免洗脱过快，使色带分离不清晰。

4.分离过程中，要连续不断地加入洗脱剂，并保持一定高度的液面，在整个操作过程中应注意不使氧化铝表面的溶液流干。

5. SbCl3腐蚀性较强，使用过程中勿接触皮肤。SbCl3遇水生成碱式盐[Sb（OH）2Cl]，再变成氯氧化锑（SbOCl），此化合物与胡萝卜素不发生作用，可出现浑浊。

【思考题】

1.吸附色谱法的基本原理是什么？

2.为使胡萝卜素的分离效果更佳，操作中应注意什么？