实验9　水蒸气蒸馏操作练习

【实验目的】

1.了解水蒸气蒸馏的原理及应用范围。

2.掌握水蒸气蒸馏的实验装置和操作方法。

【实验原理】

水蒸气蒸馏（见2.2.7节）。

【实验装置】

水蒸气蒸馏装置（见2.2.7节）。

【实验用品】

仪器：三口烧瓶，圆底烧瓶，T形管螺旋夹，蒸馏头，螺帽接头，空心塞，直形冷凝管，真空接引管，锥形瓶，量筒，三角漏斗，玻璃管，分液漏斗等。

试剂：苯甲醛，水。

【操作步骤】

1.安装水蒸气蒸馏装置

常用的水蒸气蒸馏装置，包括蒸馏、水蒸气发生器、冷凝和接收器4个部分。

在水蒸气蒸馏装置图中，A是水蒸气发生器，通常盛水量以其容积的2/3为宜。安全玻管B几乎插到发生器A的底部。当容器内气压太大时，水可沿着玻管上升，以调节内压。如果系统发生阻塞，水便会从管的上口喷出。

水蒸气导出管与蒸馏部分导管之间由一T形管连接。T形管用来除去水蒸气中冷凝下来的水，实验异常时可使水蒸气发生器与大气相通。蒸馏的液体量不能超过其容积的1/3。水蒸气导入管应正对烧瓶底中央，距瓶底8～10mm，导出管连接在一直形冷凝管上。

2.水蒸气蒸馏

在水蒸气发生瓶中，加入约占容器2/3的水，待检查整个装置不漏气后，旋开T形管的螺旋夹，加热至沸。当有大量水蒸气产生并从T形管的支管冲出时，立即旋紧螺旋夹，水蒸气便进入蒸馏部分，开始蒸馏。在蒸馏过程中，通过水蒸气发生器安全管中水面的高低，可以判断水蒸气蒸馏系统是否畅通，若水平面上升很高，则说明某一部分被阻塞了，这时应立即旋开螺旋夹，然后移去热源，拆下装置进行检查（通常是由于水蒸气导入管被树脂状物质或焦油状物堵塞）和处理。如由于水蒸气的冷凝而使蒸馏瓶内液体量增加，可适当加热蒸馏瓶。但要控制蒸馏速度，以2～3滴/秒为宜，以免发生意外。

当馏出液无明显油珠，澄清透明时，便可停止蒸馏。其顺序是先旋开螺旋夹，然后移去热源，否则可能发生倒吸现象。

【思考题】

1.水蒸气蒸馏的用途和条件？

2.安全管与T形管的作用？

3.蒸馏部分蒸汽导入管的末端为什么要插入到接近于容器底部？为何要辅助加热？

4.如何判断水蒸气蒸馏可以结束？

5.水蒸气蒸馏结束时，为何要先打开螺旋夹？

2.2.8　纸色谱

色谱法（chromatography）亦称色层法、层析法等，是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法首创于1903年，俄国植物学家茨维特首次成功地进行了植物色素的分离。将色素溶液流经装有吸附剂的柱子，结果在柱的不同高度显出各种色带，而使色素混合物得到分离。色层分析由此而得名。

色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开；流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质（可以是固体或液体）称为固定相。根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等；根据操作条件的不同，又可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等。

色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几个方面：①分离混合物，尤其是用化学方法很难分离的一些结构、性质相似的化合物；②精制提纯化合物；③利用比移值（Rf值）鉴定化合物；④观察一些化学反应是否完成。

1.原理

纸色谱为在纸上将混合物进行分离的色谱方法，分为分析型和制备型纸色谱。多数情况下，纸色谱的原理属于分配色谱原理，色谱滤纸为支持剂，滤纸纤维可以吸附25%～30%的水分，其中6%～7%的水分和滤纸结构中的羟基以氢键结合，为固定相。其他溶剂可自由通过，为流动相。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。物质被分离后在纸色谱图谱上的位置用Rf值（比移值）来表示：

Rf值=原点到色谱点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定条件下，某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多均会影响有效分离。

但由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。作为药品鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的颜色（或荧光）与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。作为药品的纯度检查时，可取一定量的供试品，经展开后，按各药品项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色（或荧光）的强度。作为药品的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定。

无色物质的纸色谱图谱可用光谱法（紫外线照射）或显色法鉴定，氨基酸纸色谱图谱常用茚三酮显色法鉴定。

纸色谱适用于极性较大的亲水性化合物或极性差别较小的化合物的分离。

2.实验方法

（1）下行法

将供试品溶解于适当的溶剂中制成一定浓度的溶液。用微量吸管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径为2～4mm，点间距离为1.5～2.0cm，样点通常应为圆形。

将点样后的色谱滤纸上端放在溶剂槽内并用玻璃棒压住，使色谱纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。

展开前，展开室内用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和，一般可在展开室底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开室内壁上，放置一定时间，待溶剂挥发使室内充满饱和蒸气。

然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸，标明展开剂前沿位置，待展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。

（2）上行法

点样方法同下行法。展开室内加入展开剂适量，放置待展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升。除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。

展开可以向一个方向进行，即单向展开；也可进行双向展开，即先向一个方向展开，取出，待展开剂完全挥发后，将滤纸转动90°，再用原展开剂或另一种展开剂进行展开；亦可多次展开、连续展开或径向展开等。

3.注意事项

①层析纸使用前应在100℃的烘箱中干燥1～2h，否则会产生拖尾现象。

②画线时只能使用铅笔，不能使用其他笔。其他笔的颜色为有机染料，在有机溶剂中染料溶解，颜色会产生干扰。

③无论是画线还是点样，不能用手接触层析纸前沿线以下的任何部位，因为，手指上有相当量的氨基酸，并足以在本实验方法中检出，干扰实验的进行。

④纸色谱须在密闭容器中展开。加入展开剂后，再等20min左右，使标本缸内形成此溶液的饱和蒸气。

⑤喷有显色剂的层析纸，在烘干时应注意温度的控制，温度太高，不但氨基酸会产生颜色，茚三酮也会产生颜色，干扰实验现象的观察。

⑥Rf值随分离化合物的结构，固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素而变化。当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。

2.2.9　薄层色谱

薄层色谱（TLC）是近代发展起来的一种微量、快速而又简单的实验技术，它具有柱色谱和纸色谱的优点，不仅适用于小量样品（几微克）的分离，也适用于较大量样品的精制（可达500mg），特别适用于挥发性较小，或在较高温度下容易发生变化而不能用气相色谱分离的化合物。常用的有吸附色谱和分配色谱两种。

薄层色谱是在洗涤干净的玻璃板上均匀涂一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后，将样品溶液用毛细管点在起点处，置薄层板于盛有少量展开剂的容器中，待展开剂到达前沿后取出，晾干，喷显色剂，测定色斑位置，计算Rf值。

1.吸附剂

一般来说，柱色谱所用的吸附剂同样可用于薄层色谱。目前最常用的是硅胶和氧化铝，因为它们的吸附能力强，可分离的化合物类型比较广泛。其次是聚酰胺、硅酸镁、滑石粉等，而氧化钙、氧化镁、氢氧化钙（镁）、淀粉、蔗糖等因碱性太大或吸附性太弱，用途有限。化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附能力较强，因而Rf值就小。因此，利用化合物的极性不同，可将它们分开。

2.薄层板的制备

根据薄层载片的大小，称取适量的吸附剂（每块3cm×10cm的载片约用1g），置于研钵中，加入一定比例的蒸馏水（硅胶约1∶2，氧化铝约1∶1），调成糊状物，然后采用如下两种涂布方法，制成薄层板。

（1）平铺法

可用自制的涂布器如图2-35所示，将洗净的几块玻璃板在涂布器中间摆好，上下两边各夹一块比前者厚0.25～1mm的玻璃板，将调好的糊状物倒入涂布器槽中，然后将涂布器自左向右推去，即能将糊状物均匀涂于玻璃板上。若无涂布器，也可在玻璃板的左边倒入糊状物，然后用边缘光滑的不锈钢尺或玻璃片自左向右将糊状物刮开，即得一定厚度的薄层。

（2）倾注法

将调好的糊状物倒在玻璃板上，用手指夹住玻片两边左右摇晃，使表面均匀光滑（必要时可于平台处让一端接触台面，另一端轻轻跌落数次并互换位置），水平放置晾干。

薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果，薄层应尽量均匀而且厚度（0.25～1mm）要固定，否则，在展开时溶剂前沿不齐，色谱结果也不易重复。

把涂好的薄层板放于室温晾干后，置烘箱内加热活化。硅胶板于105～110℃烘干30min，氧化铝板于150～160℃烘干4h，可得Ⅱ～Ⅳ活性级的薄层，活化后的薄层板放在干燥器内保存备用。

3.点样

首先用铅笔在距薄层板长端8～10mm处画一条线，作为起始线，其上标出要点样品的位置及各个样品的编号或名称。然后取一根截齐管口的细的毛细管，蘸取样品溶液少许（一般以氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、苯、乙醚或四氯化碳等低沸点溶剂，配成1%溶液），垂直地轻轻点在先前画好的点上，如图2-36所示。由于铺层疏松，吸液力强，容易造成点样太多，而使样品点太大，因此要特别小心。一旦毛细管与吸附剂接触，即要迅速移开，让溶剂挥发。如果样品浓度太低，可在原位置上重复点样一次或多次，每次点样都应点在同一圆心上。点的次数依样品溶液浓度而定，一般为2～5次，不要太多，以防拖尾。点样时不能太用力，否则易将吸附剂层戳破。样品点的直径在3mm左右为宜，两侧的点，不要太靠近边缘，以减少边缘效应。

4.展开

薄层色谱展开剂的选择，主要是根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。溶剂的极性越大，对同一化合物的洗脱力越大，也就是说Rf值越大（如果样品在溶剂中有一定溶解度）。薄层色谱用的展开剂绝大多数是有机溶剂。

取一展开槽，向其中加入已选择好的按一定比例配制成的展开剂，然后将玻璃板倾斜放入其中，板的样品一端应浸在溶剂中，另一端则用木块垫高。调整木块位置，使液面与玻板的界线与铅笔线相平行。注意不要让样品点浸没在液面以下，否则样品将被溶解。没入部分两端也要一样齐，不能倾斜，否则斑点将不能以直线方向移动，影响Rf值的计算。待溶剂前沿快移动至玻板高端时取出（不要使溶剂爬过头），快速画出溶剂前沿，如图2-37所示。

5.显色

待溶剂挥发干后，对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸锌、荧光黄）的薄层板，可在紫外光下观察，如分子中有发色基团或生色基团，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。

薄层色谱还可以使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。具体使用的显色剂及配方，请参照有关的分析化学手册或专著。

另外，也可以用卤素斑点实验法来使薄层色谱斑点显色，这种方法是将几粒碘置于密闭容器中，待容器充满碘的蒸气后，将展开后的色谱板放入，碘与展开后的有机化合物可逆地结合，在几秒到数分钟内化合物斑点的位置呈黄棕色。但是当色谱板上仍有溶剂时，由于碘蒸气亦能与溶剂结合，致使色谱板显淡棕色，而展开后的有机化合物则呈现较暗的斑点。

色谱板自容器中取出后，呈现的斑点一般在2～3s内消失，因此必须立即用铅笔标出斑点的位置（如发现拖尾太长，“尾巴”不用圈入），然后计算Rf值。

出现“拖尾”现象，往往是点样次数过多或样品浓度太高造成的，会影响Rf值的测定。因此配制适当浓度的样品，控制点样的次数是能否顺利展开的关键之一。