第二节　化学发光仪

一、基本组成

化学发光仪主要由三部分组成：样品室、检测系统、信号处理系统（图9-8）。

1.样品室

样品室是为化学发光反应物提供反应的场所，必须置于密封的暗室中，以便有效地隔离杂散光，避免外界光的干扰。样品室与光电倍增管之间应设有保护光电管阴极的快门。样品与试剂的混合方式可分为静态注射方式（图9-8）和流动注射方式（图9-9），流动注射方式将在流动注射化学发光分析一节中进行详细阐述。

2.检测系统

检测系统主要包括光电倍增管和负高压电源。光电倍增管用于定量检测化学反应发光的光强度。负高压电源的稳定性对光电倍增管增益影响很大，所以要求负高压电源稳定性必须优于0.1%。对微弱发光体系，负高压电源稳定性应达0.05%以上，负高压越高光电倍增管的增益越大，发光测量的灵敏度越高。

3.数据处理与记录系统

按检测器的工作方式，数据处理的方式可分为二类：直流电压型和交流光子计数型。

（1）直流电压型：

早期市售液相化学发光仪多为注射进样的直流电压型发光仪，放大器为直流放大。在样品室中快速混合样品和试剂后，测量化学发光强度随时间的变化轮廓。定量分析可以用峰高，也可以用混合点开始经过一个固定延滞时间的积分面积或者整个峰的积分面积进行计算。

（2）光子计数型：

光子计数型发光仪如图9-10所示，在弱发光体系中光电倍增管输出的信号为各个离散的脉冲状态，以各脉冲数作为信号，经脉冲高度甄别器将其与噪声脉冲分离，具有很好的稳定性和信噪比，因此有较高的灵敏度和重现性，线性范围宽，特别适合于微弱发光体系的定量分析。

早期的发光仪采用模拟数据在电表上显示或用记录仪记录，随着计算机技术的迅速发展，信号采集系统与计算机相结合使得化学发光的信息处理内容更丰富、速度更快捷。

二、基于不同混合方式的化学发光分析仪

（一）流动注射化学发光分析仪

在分析化学中，化学发光通常是在比较快的反应中产生的，因此，必须同时满足以下两个条件，化学发光分析才能具有实际应用价值：一是化学发光现象必须在化学反应进行的同时同步进行光检测；二是被分析物与发光反应试剂的混合重现性好。所以，直到丹麦分析化学家Ruzicka和Hansen提出流动注射分析法（flow injection analysis，FIA）以后，具有实际分析应用能力的化学发光方法才得到了巨大的促进和长足的发展。流动注射是自动分析的一种形式，它让样品和试剂在流入导管时产生混合，其混合的程度可以通过选择一定的流速条件来控制。不像一般的流动分析，流动注射分析不使用气泡来隔断流路。采用注射的方法是进行快速、重现测量的最方便手段，它特别适用于自动化化学发光分析。

流动注射分析的装置一般由驱动系统（蠕动泵）、进样阀、混合反应器、检测器和记录系统组成。当上述的流动注射分析的流路中的溶液更换成化学发光反应溶液、检测器变成化学发光检测器时，就构成了流动注射化学发光分析（CL with FIA，FIA-CL）系统。以下几个方面的问题在很大程度上会直接影响到流动注射化学发光分析仪的性能：

1.避光问题

流动注射化学发光分析中一个特别需要注意的问题：检测器要绝对避光，否则就会引起很高的、无法控制处理的背景噪声。尽管检测器避光是非常容易做到的，但是很多时候，流路所使用的管道会引起类似的光纤传导作用而造成光直接到达检测器的情况。

2.流路构成

与其他的流动注射分析技术相比，在设计流路构成时，试剂和载流的数量是很重要的方面。在实际工作过程中，试样一般都是先注入载流，再与化学发光试剂混合，产生化学发光反应。当然，流路的设计还与化学发光反应的速度有关系。如果反应是相对比较慢的，试样就可以直接注入化学发光试剂流路中。因为即使这样，反应的最大发光强度也不会在流路混合溶液进入流通池前产生。如果反应速度很快，试样就应该先注入一个独立的载流中，再在离混合流通池入口附近与化学发光试剂混合。

3.流通池体积

理想状况下，化学发光反应从开始到完成的整个过程最好能恰好发生在混合流通池中。然而，由于受到实际条件的限制，不可能按照每个单独反应的要求而随意改变流通池的体积。

4.试样体积

当试样和标准溶液的体积增大时，峰高和峰面积、信号时间都会变大。但是，如果试样体积过大，会导致浓度梯度差异变大（载流与试样间的对流和分子扩散受限，边缘交界处很大，而中间很小），这时很有可能会出现峰分裂的现象，导致错误的分析结果。

（二）顺序注射化学发光分析仪

顺序注射分析（sequential injection analysis，SIA）是在流动注射分析基础上发展起来的一种自动化溶液处理与分析方法。顺序注射分析系统的装置示意见图9-11。在顺序注射分析系统中，溶液驱动靠的是一个由注射器和步进电机所组成的注射泵P，而它的阀则是一个多通道的选择阀V。选择阀由一个位于转子上的中央公共通道和6～8个位于定子上的可供选择的支通道所组成。公共通道通过一个储液管H（与流动注射分析中的反应盘管相似，但容积大）与注射泵相连，而支通道则分别与检测器D、试样S、试剂R₁、R₂等相连。在电脑控制下，将选择阀的公共通道顺序切换至连接试样S、试剂R₁、R₂的支通道，同时协调注射泵的抽吸，依次从相应的储液瓶中吸取一定体积的试剂、试样，并将它们储存在储液管HC中。然后，将选择阀的公共通道切换至连接检测器的支通道，并使注射泵反向推注，将试剂、试样溶液区带推至检测器。在注射泵抽吸和推注的过程中，由于扩散和对流作用引起试样区带和试剂区带相互渗透和混合，进而发生化学反应生成可以检测的产物，当试样带流经检测器时，产生与流动注射分析相似的峰形信号。与流动注射分析相比，顺序注射分析具有以下特点：①只有一条流路，结构简单，可靠性好；②注射泵和选择阀非常便于电脑控制，抽取试剂和试样的体积可以精确到数微升水平，且长期运行的稳定性好；③所消耗的试样和试剂体积很小；④顺序注射分析的单流路特性，决定了它处理溶液的速度明显不如流动注射分析系统。

（三）停流化学发光分析仪

对于一些反应速率不是非常快的体系，往往希望通过延长反应时间来深化反应进行的程度，提高产率。在流动体系中，延长反应时间可以通过增加反应管道的长度来实现。但是，试样带的分散度会随反应管道的长度增加而增大。因此，对于反应速率较慢的体系，增加反应管道长度使反应产物增加所带来的收益往往被过度地分散而抵消。在这种情况下，可以采用停流技术来延长反应时间。停流技术是在试样带注入载流并与试剂发生反应后进入检测器或到达检测器前使之停止流动一段时间。在这段时间内，化学反应依然进行，然而分散却几乎不进行，由此增加反应物的产率，提高测定的灵敏度。