第三节　化学发光分析技术

一、化学发光的影响因素

化学发光的分析性能受所有参与化学反应的组分和发射组分的发光特性的影响，因此，控制化学反应条件是十分重要的。影响化学发光的主要因素有化学反应速度、反应试剂混合速度和发光增敏剂。

1.反应速度

化学发光强度在一定条件下与化学反应速度呈正比。如果反应速度慢，发生微弱慢发光，则几乎测不到光的信号。对同一个反应体系，如果能改变反应条件加快反应速度，发光能在瞬间完成，就可以测到一个较强的信号，化学发光分析的灵敏度与反应速度直接相关。因此，影响反应速度的因素诸如温度、浓度、pH、竞争反应、共存物质的催化或抑制作用等都会影响发光分析。

2.反应试剂混合速度和混合方式

化学发光的强度与反应时间的曲线在开始时强度增加（图9-2），这是由于试剂混合需要一定时间或反应处于诱导期，达到最大值时信号开始下降，这是由于试剂的消耗和化学发光的光量子效率随着间改变而引起的。混合速度影响化学发光反应过程动力学，也就影响体系的反应速度，最终影响到化学发光的强度，因此，在化学发光分析检测时必须严格控制反应体系的混合速度和混合方式，以确保化学发光反应体系的稳定。混合方式可以利用进样力，也可以借助磁力搅拌或搅拌器加速混合。为了防止信号损失，混合和测定应同时在光电倍增管的窗前进行。

3.发光反应试剂的浓度

在发光反应体系和化学发光的光量子效率一定的情况下，化学发光的强度取决于化学反应动力学。参与化学发光反应的试剂是影响化学反应动力学的主要因素，化学发光强度随反应试剂的浓度增大而增大，但必须考虑浓度大时的背景干扰和试剂浪费。因此，需在满足分析要求的同时尽可能地减少试剂的用量。

4.溶液的pH

溶液的pH影响被测物质和发光体的存在形态或发生其他副作用，对发光体系产生严重的影响。每个发光体系的最佳pH条件应该通过试验确定，并严加控制。例如，用鲁米诺-H₂O₂发光体系测定Cr3+时，试液pH为2.50，鲁米诺分析液的pH为12.60，反应混合液的pH控制为10.95时可获得最大发光强度。

5.催化剂

一些化学发光反应速度较慢，发光强度小。某些试剂加入以后可大大加速发光反应的进行，使发光强度增强。这些试剂就是化学发光反应的催化剂。化学发光反应常用的催化剂有金属离子、过氧化物酶、卟啉类金属配合物等。近年来，随着纳米技术的飞速发展，纳米离子对化学发光反应的极佳催化效果被人们所发现，纳米粒子参与的化学发光反应已成为化学发光领域的研究热点。利用各种催化剂对化学发光反应的催化作用这一特点，可以通过化学发光反应实现多种物质的测定，如Cu、Mn、Co、Fe、Cr、Hg、V等金属离子和H₂O₂等。例如，利用Fe2+对鲁米诺-H₂O₂的化学发光反应的催化作用原理，可实现对深海中低至0.05nmol/L Fe（Ⅱ）和总Fe的测定。

6.发光增敏剂

在化学发光反应中加入某种发光增强剂，可使发光体系的发光强度大大增加，且发光衰减缓慢，增加了发光检测的灵敏度和特异性，提高了检测的稳定性。常见的发光增强剂有卤酚类，如对碘苯酚、对溴苯酚等；萘酚类，如β-萘酚、α-溴-β-萘酚等；酚代用品，如对碘基苯酚；胺衍生物类，如3-氨基荧蒽；以及6-羟基苯并噻唑衍生物类，如甲壳虫动物荧光素、脱氢荧光素等。例如用辣根过氧化物酶（HRP）标记生物分子，H₂O₂作氧化剂，在鲁米诺（luminol）-HRP-H₂O₂体系中加入发光增强剂对碘苯酚，能使发光强度增大1000倍以上。

7.流速

流通池的体积不足可以通过精确地控制每一个参与反应的流路的流速来弥补。在实际工作中，可以通过改变优化泵的工作条件来调节流速，从而实现达到控制化学发光溶液到达流通池的驻留时间。流速与化学发光反应的速度直接相关。当化学发光反应速度增加时，流速也要相应地提高。当然，此时试剂的消耗量也会增大。另外，流速会影响化学发光的峰形、峰高和样品通量（也就是单位时间内测定试样或标准溶液的个数）。

在实际分析中要综合考虑各方面的因素，选择合适的条件，既要有利于前处理及分离，又要保证能较好地检测。

二、化学发光分析法的应用

1.无机物的分析

Cr3+是生物所需微量元素之一，微量铬可提高植物体内过氧化酶和多酚氧化酶活性，增加叶绿素和葡萄糖含量，使产量大幅度提高。但土壤含铬量大于一定限度时会毒害某些植物的根，阻碍植物对钙、镁、磷和铁等元素的吸收，出现缺铁失绿现象甚至死亡。

应用化学发光分析法测定环境水样、土壤和生物样品、粮食和食品中的微痕量铬，具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽、成本低廉等特点而显著优于其他分析方法。所依据的原理是：样品经混酸用微波消解为试液后，用亚硫酸盐将Cr（Ⅵ）还原为Cr3+，利用Cr3+对碱性鲁米诺-H₂O₂化学发光体系的线性催化作用，定量测定样品中的铬。

该体系在适量EDTA和PAN联合配位剂存在的条件下，试液中常见的Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Fe2+、Co2+和NO₃-、NO₂-、CO₃2-、SO₄2-、SiO₃2-等离子均不干扰，所以该法测铬有很好的选择性，检测下限为6.2×10-13g/ml。

2.有机物的测定

有机化合物可以多种形式参与化学发光反应，如被测组分作为反应物、催化剂、猝灭剂、能量受体等参与化学发光反应。利用化学发光分析已测定了苊、芘、蒽、苯并芘、苯并蒽、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、多巴胺类、抗癌药物、抗生素类药物等。

3.生物医学领域的应用

将酶促反应与化学发光相耦合，以生物分子作为测定对象，把生物能量转化为化学发光信号而输出，通常称为化学发光生物传感器。该方法利用酶的特异性，克服了化学发光分析选择性差的缺点，从而使它兼具化学发光分析的高灵敏度和酶法分析的专一性。这类传感器的应用中以H₂O₂的检测最为常见。许多酶能催化底物氧化或还原，并产生或消耗H₂O₂，将这些酶固定化作为接受器，辣根过氧化酶作为换能器，已广泛用于测定生物样品中的葡萄糖、尿酸、乳酸、胆固醇、蛋白质、DNA、RNA、胆碱、乙酰胆碱、肌酐、嘌呤类等物质。