第一节　化学发光分析基础理论

一、化学发光的产生过程

在没有任何光、热或电场等激发的情况下，反应体系中的某些物质分子吸收了化学反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，受激分子再由激发态返回到基态时，能量以光的形式辐射出去，完成一个化学发光过程。其过程可以通过图9-1所示的两个过程来表示。

这一过程可以用如下反应式来表示：

（1）直接氧化还原反应产生化学发光的过程：

（2）能量转移产生化学发光的过程：

此外，还存在另一种情况的化学发光反应过程：间接化学发光。间接学发光分析过程包含两个化学反应，第一个反应能够定量生成某一化学发光反应体系所需反应物（或催化剂），另一个反应则为相应的化学发光反应。根据化学发光强度可以测定第一个反应中某一反应物的含量。间接化学发光过程如下：

二、化学发光产生的条件

化学发光的产生必须满足以下条件：

1.充分的能量化学反应必须能释放出足够的能量（170～300kJ/mol），以引起电子激发；由于化学激发的瞬时性，这个能量必须由某一步骤单独提供。因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不遗留至下一步。许多氧化还原反应所提供的能量与此相当，因此大多数化学发光反应为氧化还原反应。

2.形成激发态中间产物至少要有一种物质能够接受化学反应提供的能量，并能有效地生成激发态产物。对于有机物分子的液相化学发光来说，容易生成激发态产物的物质通常是芳香族化合物和羰基化合物。

3.能量以光的形式释放要观察到化学发光现象，激发态分子必须在反应条件下能够以光的形式释放能量回到基态。

三、化学发光法的定量基础

化学发光的光量子效率（Φ_CL）取决于受激分子的生成效率（Φ_ex）和受激分子的发光效率（Φ_L）两个方面，并为二者的积。受激分子的生成效率是产生受激分子的部分占母体反应物分子总数的比例，受激分子的发光效率则是发射出的光子数占总受激分子的比例。对于大多数用于分析的化学发光反应来说，化学发光的光量子效率在0.001～0.1之间。

化学发光的光量子效率定义为：

式中N_a为阿伏加德罗常数。

由（式9-1）可见，在化学发光的光量子效率一定的情况下，反应体系产生的光子数与化学发光前体物的量有关。在所有的化学发光过程中，化学反应体系的化学发光强度依赖于化学发光的光量子效率和反应动力学。（式9-2）给出了t时刻的化学发光强度与发光反应速率的关系：

式中：I_CL（t）为t时刻的发光强度（光子/秒）；-dc/dt为分析物的反应速率（即化学发光前体物的消耗速率，单位为反应分子数/秒）。

在将反应物混合后，由于化学发光物母体的不断消耗，化学发光强度将随反应时间而衰减，化学发光强度随反应物混合时间变化的关系曲线如图9-2所示。

当化学发光反应的试验条件确定时，在一定的浓度范围内，最大发光强度与待测物的初始浓度呈正比，其关系可表示为：

式中：c为待测物的浓度（mol/L）；K在一定验条件下是一个常数；I_CLmax为最大发光强度。

对于一定的化学发光体系，总化学发光强度I_CL则为：

（式9-3）和（式9-4）为化学发光分析的定量依据。

四、常见的化学发光体系

在化学发光分析中，发光体系是一个重要的部分。在不断地研究与实践中，人们发现了许多化学发光的发光体系，在生命科学研究领域应用较多的体系有以下几种。

1.鲁米诺发光体系

鲁米诺是发现最早和应用最多的化学发光化合物，传统的鲁米诺发光体系一般由发光剂（鲁米诺、异鲁米诺等）、氧化剂和催化剂组成，其反应机理如下（图9-3）：

在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂［如H₂O₂、K₃Fe（CN）₆、NaClO、KIO₄、KMnO₄及活性氧等］氧化而发光，其中H₂O₂最为常用。但鲁米诺氧化发光的反应速度较慢，通常需要添加某些酶类或无机催化剂来加快反应的进行。常用的酶类有辣根过氧化酶、过氧化氢酶、血红蛋白等，无机类催化剂如Fe3+、Cr3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物等。

2.吖啶类化合物发光体系

光泽精（lucigenin）是第一个被发现有化学发光性质的吖啶类化合物，这类化合物在H₂O₂和OH-存在时能迅速产生化学发光。光泽精的化学发光机理为（图9-4）：

光泽精发光体系本身是一个非常缓慢的氧化反应，当Sn4+，Fe2+，U3+等金属离子作为催化剂时，光泽精发光体系的发光速率急剧加快，发光强度也随之增强。另外，还有很多有机化合物对光泽精的化学发光有明显的增强作用，如抗坏血酸、尿酸、羟胺、丙酮等。因此该化学发光体系主要被用于无机还原剂和有机还原剂的测定。

3.过氧化草酸酯类化合物发光体系

过氧化草酸酯类（peroxyoxalate）化学发光体系是指芳香草酸酯、过氧化氢和荧光剂组成的化学发光反应。过氧化草酸酯类的化学发光机理如下图9-5所示。

过氧化草酸酯类化合物的化学发光反应被认为是目前效率最高的非酶催化的发光反应体系，最大的量子产率高达34%。过氧化草酸酯类化学发光体系与鲁米诺和其他化学发光反应不同，它必须由加入的荧光物质通过能量转移产生明显的化学发光。当加入的荧光物质的种类不同时，发出光的颜色也不同。由于该发光反应体系具有产率高、强度大、寿命长的特点，过氧化草酸酯类试剂除了在分析化学领域被广泛地研究和应用，还适合于各种化学光源的研制与开发。

4.钌（Ⅱ）联吡啶配合物发光体系

钌（Ⅱ）联吡啶配合物（［Ru（bpy）₃］2+）也是常用的化学发光体系之一。它具有独特的化学稳定性、氧化还原能力和发光性质。激发态｛［Ru（bpy）₃］2+｝*的最大发光波长在620nm处，呈橘红色发光。在酸性介质中，氧化剂如PbO₂，Ce（Ⅳ）、KMnO₄等将［Ru（bpy）₃］2+氧化成［Ru（bpy）₃］3+，后者再与还原性分析物发生反应生成激发态［Ru（bpy）2+］*而产生化学发光。但目前利用钌（Ⅱ）-联吡啶配合物氧化还原反应进行的化学发光分析研究较少，大多数的研究是利用电化学法进行电极氧化产生化学发光，即电致化学发光分析，这将在下一节详细介绍。

5.二氧杂环烷类化合物发光体系

1，2-二氧杂环烷类化合物经单分子转变后生成含羰基的产物，产物之一为激发态，产生化学发光。二氧杂环烷类化合物的化学发光机理为（图9-6）：

在二氧杂环烷类化合物结构中的—O—O—键很不稳定，且四元环存在较大的张力能，因而在反应过程中会释放大量能量并满足化学发光反应的能量需求。研究发现：在许多化学发光和生物发光的中间体中可能生成这种过渡态。目前已报道了100多种二氧杂环烷类的化合物，并得到广泛的研究和应用。

6.高锰酸钾化学发光体系

目前，关于高锰酸钾参与的化学发光体系的研究依然比较活跃。高锰酸钾作为氧化剂能与很多生物碱直接发生氧化还原反应产生化学发光。关于高锰酸钾化学发光的机理尚还没有定论，但是大多数研究都认为高锰酸钾与还原剂发生氧化还原反应，产生激发态中间体，激发态返回基态时发出光，或激发态分子能量转移给荧光物质，使荧光物质发出荧光。高锰酸钾化学发光应用的体系也比较多，有高锰酸钾在酸性溶液（碱性）中直接与药物反应的高锰酸钾-酸性（碱性）体系；有高锰酸钾-甲醛（乙二醛、戊二醛）-药物的化学发光体系；高锰酸钾-罗丹明B（6G）-药物的化学发光体系；高锰酸钾-亚硫酸钠（硫代硫酸钠、连二亚硫酸钠）-药物的化学发光体系；高锰酸钾-过氧化氢-药物的化学发光体系等。利用这些体系，可以测定的药物有氨基酸、头孢类药物、磺胺类药物、大环内酯类抗生素、激素、毒品等。

7.四价铈化学发光体系

四价铈Ce（Ⅳ）也是一种重要的化学发光氧化剂，在酸性介质中，Ce（Ⅳ）氧化还原电位为1.72V，与很多还原性物质（如二氧化硫、亚硫酸盐等）发生氧化还原反应时可产生微弱的化学发光，可以利用此体系直接测定相关物质。Ce（Ⅳ）化学发光体系的应用大多集中于有机化合物，应用于药物分析的Ce（Ⅳ）化学发光体系多为Ce（Ⅳ）-罗丹明6G（B）-药物化学发光体系；Ce（Ⅳ）-亚硫酸钠（连二亚硫酸钠）-药物化学发光体系；Ce（Ⅳ）-铽-亚硫酸钠-药物化学发光体系；Ce（Ⅳ）-钌（Ⅱ）联吡啶（邻菲罗啉）-药物化学发光体系以及用Ce（Ⅳ）作氧化剂在酸性溶液中直接与药物反应等。Ce（Ⅳ）在氧化一些含有巯基或含硫的药物时，化学发光一般很微弱，常用一些荧光物质（如奎宁、罗丹明B或罗丹明6G等）来增敏化学发光，如卡托普利、青霉胺、巯基酰甘氨酸、双氢克尿噻、酚噻嗪等药物的测定。

8.超常态金属配合物体系

由于具有强氧化性和优异的催化能力，超常态金属配合物在近年来备受关注。文献中已报道的超常态金属配合物都是由高氧化态的过渡金属与合适的配体组成的配合物，如图9-7所示。其中，Ag（Ⅲ）、Cu（Ⅲ）、Ni（Ⅳ）的超常态金属配合物得到了较为广泛的应用。Ag（Ⅲ）、Cu（Ⅲ）、Ni（Ⅳ）可与鲁米诺、荧光素在碱性条件下实现对6-巯基嘌呤、异噻酰胺、肾上腺素、硫酸双肼屈嗪、莱克多巴胺、非诺特罗、抗坏血酸、尿酸、还原性谷胱甘肽、氧化性谷胱甘肽等物质的分析测定，也可利用自身的强氧化性在酸性或碱性条件发生直接的氧化还原反应实现对氟喹诺酮类、阿魏酸、林可霉素等的测定。

9.过氧化物体系

近些年，人们发现过氧化氢及其取代物可直接氧化一些物质产生化学发光，并依此建立了相应的化学发光分析方法。这些过氧化合物包括过氧化氢（HOOH）、过氧亚硝酸（HOONO₂-）、过氧硫酸盐（HOOSO₃-）、过氧碳酸盐（HOOCO₂-）和过氧亚硫酸盐（HOOSO₂-）等。一般来说，这些过氧化物都具有很强的氧化性，均有活性氧自由基生成并参与发光过程。研究人员利用过氧化物的这些特点，实现了亚硝酸盐、硝酸盐、喹诺酮类、多酚类化合物、叶酸、甲硫氨酸、苯并［a］芘-7，10-醌等的测定。