1.3 鸡油菌状灵芝胞外多糖
本工作以在不同搅拌方式下的鸡油菌状灵芝（伞灵芝）液体深层发酵所产的胞外多糖为研究对象。首先，通过单因素实验和统计学方法优化了生产胞外多糖（exopolysacchride，EPS）的最佳发酵条件，并研究了发酵过程中菌丝体的形态学变化；其次，通过使用凝胶层析、气相色谱仪、红外光谱仪、热重分析仪和刚果红实验对不同搅拌方式下所得胞外多糖进行初步分子表征；最后，采用水杨酸法和DP P H法测定胞外多糖的抗氧化活性。结果如下：鸡油菌状灵芝最佳培养时间为8d，最佳碳氮源分别为葡萄糖和蛋白胨。鸡油菌状灵芝搅拌罐胞外多糖含有两个组分（Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ）而气升罐胞外多糖为单组分，Fr－Ⅰ、Fr－Ⅱ和气升罐胞外多糖均为酸性β－吡喃糖，Fr－Ⅰ分子质量为627.672ku，主要单糖成分为甘露糖∶葡萄糖＝8.54∶1。Fr－Ⅱ分子质量为74.563ku，主要单糖组成为葡萄糖∶甘露糖＝1.30∶1。气升罐胞外多糖分子质量为40.567ku，主要单糖组成为葡萄糖：甘露糖＝51.23∶1。Fr－Ⅰ、Fr－Ⅱ和气升罐胞外多糖的降解温度分别为215℃、180℃和101℃，且均含有糖醛酸。Fr－Ⅱ的·OH清除率最高达到30.08%，气升罐胞外多糖的·DPPH清除率最高达到22.54%。
1.3.1 鸡油菌状灵芝培养条件的优化
优化培养条件方案同1.1.1。
鸡油菌状灵芝菌丝干重和EPS产量的变化见图1.19。确定最佳培养时间为8d，此时目标产物EPS的产量达到最大。
图1.19 鸡油菌状灵芝菌丝干重和EPS产量随培养时间的变化
（■菌丝干重，●EPS产量）
鸡油菌状灵芝碳氮源优化见图1.20。结果表明，葡萄糖作为碳源时鸡油菌状灵芝菌丝干重和EPS产量达到最大［图1.20（1）］，所以选择葡萄糖为最佳碳源；鸡油菌状灵芝菌丝干重和EPS产量分别在使用酵母粉和蛋白胨时达到最大［图1.20（2）］，最终选择蛋白胨作为最佳氮源进行后续试验。
1.3.2 胞外多糖的分离纯化及其结构分析
（1）鸡油菌状灵芝胞外多糖的纯化 鸡油菌状灵芝胞外多糖的纯化结果见图1.21。Sepharose CL－6B层析住分别分离伞灵芝搅拌式发酵罐［图1.21（1）］和气升式发酵罐［图1.21（2）］胞外多糖，搅拌罐得到两个组分，而气升罐EPS只有一个组分。重复上柱3次，得到的检验结果一致。组分对应的样品收集管中，有蛋白吸收峰，说明组分中可能含有部分糖蛋白。将Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ组分收集起来，浓缩、透析、冷冻干燥，得到胞外多糖纯品。
图1.20 不同培养基成分对鸡油菌状灵芝菌丝干重和EPS产量的影响
（■菌丝干重，●EPS产量）
图1.21 鸡油菌状灵芝胞外多糖经Sepharose CL－6B柱后多糖和蛋白的测定结果
（●490nm测定多糖，〇280nm测定蛋白）
（2）Sepharose CL－6B凝胶层析测定鸡油菌状灵芝胞外多糖分子质量 鸡油菌状灵芝胞外多糖分子质量的测定结果见图1.22。如图1.22所示可知Fr－Ⅰ、Fr－Ⅱ和气升罐EPS分子质量分别为627.672ku、74.563ku和40.567ku，且Fr－Ⅰ分子质量∶Fr－Ⅱ分子质量∶气升罐EPS分子质量＝15.47∶1.84∶1。
图1.22 Sepharose CL－6B层析柱测定鸡油菌状灵芝EPS分子质量
（3）鸡油菌状灵芝胞外多糖的单糖组分气相测定 对鸡油菌状灵芝搅拌罐胞外多糖和气升罐胞外多糖进行气相色谱分析，结果见表1.7。可以看出，搅拌罐胞外多糖Fr－Ⅰ含有6种单糖，其中主要糖成分为甘露糖81.56%，葡萄糖9.55%；Fr－Ⅱ含有7种单糖，其中主要糖成分为葡萄糖41.83%，甘露糖32.05%；气升罐EPS含有5种单糖，其中主要糖成分为葡萄糖97.34%，甘露糖1.90%。
表1.7 鸡油菌状灵芝搅拌罐和气升罐气相色谱图分析对比表
续表
（4）鸡油菌状灵芝胞外多糖红外光谱分析 鸡油菌状灵芝胞外多糖红外光谱对比图见图1.23，红外光谱分析结果见表1.8。有图谱分析结果如下：在3.4×103cm－1左右有强宽峰，是分子内的—OH键的伸缩振动所致；2.92×103cm－1左右有吸收峰，这是糖类C—H键的伸缩振动，是糖类的特征吸收；在1.64×103cm－1、1.066×103cm－1左右有吸收峰，说明有羧酸存在，因而此多糖为酸性多糖；在1.45×103cm－1左右有吸收峰为糖醛酸的伸缩振动峰；在1.1×103cm－1～1.01×103cm－1出现的吸收峰是常见的吡喃环内酯和羟基的共振吸收峰，是由于糖环上C—O—C醚键的不对称伸缩振动，构成了糖类的特征吸收峰，也是葡聚糖典型的红外光谱信号；伞灵芝组分1在8.09×102cm－1处有吸收峰说明有甘露糖的存在，综上所述，Fr－1是一种β－吡喃型酸性甘露聚糖，Fr－2为含有甘露糖的β－吡喃型酸性葡聚糖，气升罐胞外多糖是一种β－吡喃型酸性葡聚糖，且都含有糖醛酸。
图1.23 鸡油菌状灵芝胞外多糖红外光谱对比图
表1.8 鸡油菌状灵芝胞外多糖红外光谱分析结果对比
（5）不同温度下鸡油菌状灵芝胞外多糖的稳定性变化 由图1.24可知，由于Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ含有吸附水，所以当温度从室温升高到106℃时，质量急剧下降，失重率分别达到16.42%和10.78%。Fr－Ⅰ，Fr－Ⅱ和气升罐胞外多糖的降解温度（Td）分别为215℃、180℃和101℃，所以当温度高于降解温度时，多糖会发生降解。另外，Fr－Ⅰ，Fr－Ⅱ和气升罐胞外多糖急剧降解温度分别为318℃、335℃和200℃，且最终残留量分别为22.70%、23.30%和26.30%。综上所述，鸡油菌状灵芝搅拌罐和气升罐胞外多糖均表现出较高的热稳定性，而且搅拌罐和气升罐胞外多糖分别表现出不同的热稳定性和降解行为，这可能是由于搅拌罐和气升罐EPS含有不同的单糖成分。
1.3.3 胞外多糖抗氧化活性的测定
如图1.25（1）所示为伞灵芝搅拌罐和气升罐胞外多糖羟基清除率结果对比。结果表明，随着胞外多糖浓度的增加，其对羟基自由基的清除能力呈增大趋势，且搅拌罐胞外多糖的羟基清除率高于气升罐胞外多糖羟基清除率，Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ的羟基清除率能力几近相同。在胞外多糖为10mg/mL时，Fr－Ⅰ、Fr－Ⅱ和气升罐的羟基自由基清除率分别为27.08%、30.08%和5.89%。图1.25（2）为二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖·DPPH清除率结果对比。结果显示，·DPPH清除率随着气升罐胞外多糖浓度的增加而增加，随着Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ浓度的增加而降低。在EPS浓度为10mg/mL时Fr－Ⅰ、Fr－Ⅱ和气升罐的· DP P H清除率分别为7.52%、7.48%和22.54%。这些结果表明，Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ的羟基清除率高于气升罐胞外多糖，却具有较低的·DPPH清除率。
图1.24 不同温度下鸡油菌状灵芝胞外多糖稳定性变化
图1.25 鸡油菌状灵芝胞外多糖抗氧化能力浓度效应图
（●气升罐，▼Fr－Ⅰ，■Fr－Ⅱ）