1.2 二年残孔菌胞外多糖
本工作以不同搅拌方式下，二年残孔菌液体深层发酵所产的胞外多糖为研究对象。首先通过单因素实验和统计学方法优化生产胞外多糖（exopolysac-chride，EPS）的最佳发酵条件，并研究了发酵过程中菌丝体的形态学变化；其次，通过使用凝胶层析、气相色谱仪、红外光谱仪、热重分析仪和刚果红实验对不同搅拌方式下所得胞外多糖分进行初步分子表征；第三，采用水杨酸法和DP P H法测定胞外多糖的抗氧化活性；最后，研究二年残孔菌搅拌罐胞外多糖的加入对烟叶内部香味物质的种类和含量的影响。
结果表明，二年残孔菌最佳培养时间为8d，最佳碳氮源分别为乳糖和胰蛋白胨。二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖为分子质量分别为22.071ku和17.301ku的单组分多糖，含有β－糖苷键，主要单糖组成分别为葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖＝3.32∶1.95∶1和甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝9.10∶6.58∶1，降解温度分别为115℃和100℃，空间构象均为无规则卷曲。二年残孔菌· OH清除率和·DPPH清除率随着胞外多糖浓度的增加而增加，且搅拌罐和气升罐胞外多糖的抗氧化能力相差不大。加入二年残孔菌胞外多糖后酯和内酯类、酚类的含量则表现出上升趋势，酮类、醇类、醛类、呋喃类、氮杂环类的含量表现出下降趋势，其中醇类、氮杂环类含量下降明显。可以减轻烟气刺激性、改善和修饰卷烟香气，进而提高烟气整体的品质。
1.2.1 二年残孔菌培养条件的优化
优化方案同1.1.1，优化结果如下：
根据培养时间内，二年残孔菌菌丝干重和EPS产量的变化（图1.12），确定最佳培养时间为8d，此时目标产物EPS的产量达到最大。
二年残孔菌碳氮源的优化见图1.13。结果表明，乳糖作为碳源时二年残孔菌菌丝干重和EPS产量均达到最大［见图1.13（1）］，所以选择乳糖为最佳碳源；二年残孔菌菌丝干重和EPS产量分别在使用酵母粉和胰蛋白胨时达到最大［见图1.13（2）］，最终选择胰蛋白胨作为最佳氮源进行后续试验。
图1.12 二年残孔菌菌丝干重和EPS产量随培养时间的变化
（■菌丝干重，●EPS产量）
图1.13 不同培养基成分对二年残孔菌菌丝干重和EPS产量的影响
（■菌丝干重，●EPS产量）
1.2.2 胞外多糖的分离纯化及其结构分析
（1）二年残孔菌胞外多糖的纯化 二年残孔菌胞外多糖纯化结果见图1.14。Sepharose CL－6B层析住分别分离二年残孔菌搅拌式发酵罐［图1.14（1）］和气升式发酵罐［图1.14（2）］胞外多糖，均得到一个组分。重复上柱3次，得到的检验结构一致。组分对应的样品收集管中，有少量的蛋白吸收峰，说明组分中可能含有部分糖蛋白。将组分收集起来，浓缩、透析、冷冻干燥，得到二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖纯品。
图1.14 二年残孔菌胞外多糖经Sepharose CL－6B柱后多糖和蛋白的测定结果
（●490nm测定多糖，〇280nm测定蛋白）
（2）凝胶层析测定二年残孔菌胞外多糖分子质量 二年残孔菌胞外多糖的分子质量测定见图1.15。由图1.15可知，二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖分子质量分别为22.07ku和17.30ku，且搅拌罐的EPS分子质量为气升罐EPS分子质量＝1.28∶1。
（3）二年残孔菌胞外多糖的单糖组分分析 对二年残孔菌搅拌罐胞外多糖和气升罐胞外多糖进行气相色谱分析，结果见表1.3。可以看出，搅拌罐胞外多糖含有7种单糖，其中主要糖成分为葡萄糖51.45%，甘露糖30.30%，半乳糖15.51%（葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖＝3.32∶1.95∶1）。气升罐胞外多糖含有6种单糖，其中主要糖成分为甘露糖53.24%，葡萄糖38.48%，半乳糖5.85%（甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝9.10∶6.58∶1）。
图1.15 Sepharose CL－6B层析柱测定二年残孔菌EPS分子质量
表1.3 二年残孔菌胞外多糖气相色谱图分析对比表
（4）二年残孔菌胞外多糖红外光谱分析 二年残孔菌胞外多糖的红外光谱对比见图1.16。红外光谱分析结果对比见表1.4。
如图1.16和表1.4所示可知，在2.96×103～2.85×103cm－1处的吸收峰是亚甲基或其他烷基的C—H伸缩振动，是糖类的特征吸收峰；在1100cm－1～1010cm－1之间出现3个吸收峰是常见的吡喃糖环内酯和羟基的共振吸收峰，其中1.03×103cm－1处很强的吸收峰和1.06×103cm－1处强吸收峰是糖环内酯C—O—C特征吸收峰，为C—O—C的不对称伸缩振动，构成了糖类的特征吸收峰，也是葡聚糖典型的红外光谱信号；在指纹图谱区域8.9×102cm－1左右有吸收峰为β－吡喃糖苷键的特征吸收峰，是由于β－吡喃糖苷键C—H变形振动造成的；在8.0×102cm－1处有吸收峰说明有甘露糖结构。综上所述，搅拌罐和气升罐胞外多糖均为含有甘露糖和葡萄糖的β－吡喃糖。
图1.16 二年残孔菌胞外多糖红外光谱对比图
表1.4 二年残孔菌胞外多糖红外光谱分析结果对比图
（5）不同温度下二年残孔菌胞外多糖的稳定性变化 不同搅拌方式下二年残孔菌胞外多糖在不同温度下质量变化如图1.17所示，二年残孔菌搅拌罐胞外多糖和气升罐胞外多糖的降解温度（Td）分别为115℃和100℃，所以当温度高于降解温度时，多糖会发生分解现象。另外，搅拌罐和气升罐胞外多糖急剧降解温度分别为250℃和300℃，且最终残留量分别为21.61%和23.70%。综上所述，二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖均表现出一定的热稳定性，而且搅拌罐和气升罐胞外多糖表现出相似的热稳定性和降解行为，这可能是由于搅拌罐和气升罐EPS单糖成分相差不大。
图1.17 不同温度下二年残孔菌胞外多糖稳定性变化
1.2.3 胞外多糖抗氧化活性
二年残孔菌胞外多糖抗氧化能力见图1.18。二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖羟基清除率结果对比见图1.18（1）。结果表明，随着胞外多糖浓度的增加，其对·OH清除能力呈增大趋势，且搅拌罐胞外多糖的羟基清除率稍高于气升罐胞外多糖羟基清除率。在胞外多糖为20mg/mL时，搅拌罐和气升罐的羟基自由基清除率分别为16.73%和14.62%。如图1.18（2）所示为二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖· DPPH清除率结果对比。结果显示，·DPPH清除率随着胞外多糖浓度的增加而增加，且气升罐胞外多糖的清除率稍高于搅拌罐。在EPS浓度为10mg/mL时搅拌罐和气升罐的·DPPH清除率分别为10.88%和13.15%。这些结果显示，二年残孔菌搅拌罐和气升罐胞外多糖均具有一定的自由基清除能力。
图1.18 二年残孔菌胞外多糖抗氧化能力浓度效应图
（●搅拌罐，〇气升罐）
1.2.4 搅拌式发酵罐生产二年残孔菌胞外多糖在烟草上的应用
1.2.4.1 二年残孔菌薄片涂布、同时蒸馏萃取和气质联用（GC/MS）分析方法
取片基6g，胞外多糖0.6336g，涂布液3.168g，蒸馏水9.723g混匀后对片基进行涂布，空白组以蒸馏水代替多糖。涂布完成的再造烟叶先放入烘箱60℃下保持5min，再放置于恒温恒湿箱［相对湿度（60±5）%，温度（22± 2）℃］，24h后切丝，切后的薄片丝装入密封袋后放入恒温恒湿箱中备用。称取3g薄片丝以1∶10的比例和配方烟丝混合均匀，按照每支烟总质量0.80g± 0.01g的标准卷制样品，按照国标要求，在温度（22±2）℃、相对湿度（60± 5）%的恒温恒湿箱中平衡24h，平衡好的样品上吸烟机抽吸，实验组和空白组各抽吸20支，每5支换一个剑桥滤片。
结束后将剑桥滤片和擦拭捕集器的棉花放入1000mL圆底烧瓶中，加入36g氯化钠、400mL蒸馏水，同时蒸馏萃取2.5h。然后将浓缩瓶置于60℃恒温水浴锅中，当瓶中液体浓缩至约1mL左右将浓缩瓶取出，盖上塞子待液体冷却后转入色谱瓶，进行GC/MS分析。
1.2.4.2 GC/MS条件
（1）色谱柱 HP－5MS（60m×0.25mm i.d.×0.25μm d.f.）；载气、流速：高纯氦气、1mL/min；进样口温度：260℃；升温程序：50℃（3min）～280℃（10min）；分流比5∶1、进样量：1μL。
（2）温度及其他条件 传输线温度：270℃；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离能70eV；质量数范围：35～550amu；载气：高纯氦气；MS谱库：nist 02库。
结果与讨论
二年残孔菌搅拌罐胞外多糖加入卷烟后对卷烟中香味物质的影响见表1.5。
表1.5 实验组和空白组香味物质检测结果汇总
续表
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由表1.5分析可知，烟草中添加二年残孔菌胞外多糖后，烟叶中致香成分的组成、含量、比例均发生了明显的变化。例如，糖醇与空白组相比含量升高了1.06%，可增加烟气谷香和油香，增加浓度；实验组中金合欢醇含量达到1.27μg/g，而对照组中没有检出该物质，金合欢醇具有特有的青香韵的铃兰花香气，并有青香和木香香韵，这种特征香气赋予卷烟成熟的烟草气；实验组2－乙酰基呋喃增加到2.97%能增加卷烟的脂香和甜香味。这些物质具有改善和修饰卷烟香气，增加清香香韵，减轻刺激性的作用。此外，香叶基香叶醇也由空白组的1.94μg/g增加到3.40μg/g，而已知香叶基香叶醇具有广泛的生理活性，如杀毒、抗病毒、抗肿瘤等，对于多种疾病如溃疡、神经衰弱、皮肤老化、血栓、动脉粥样硬化和免疫缺失等也有一定的治疗作用。
为了进一步分析不同类型的香味物质，根据官能团不同，将检测出的致香化合物分为七类，分别是酮类、醇类、醛类、酯和内酯类、酚类、呋喃类、氮杂环类。其中，酮类包括支链烯酮类、辛酮、茚酮螺岩兰草酮和烷酮类等共11种化合物；醇类包括糠醇、金合欢醇、香叶基香叶醇等4种化合物；醛类包括糠醛、5－甲基呋喃醛、十四醛3种化合物；酯和内酯类包括乙酸苯乙酯、棕榈酸甲酯、维生素A醋酸酯等4种化合物；酚类包括苯酚、对甲苯酚、2－甲氧基苯酚等15种化合物；呋喃类包括2－乙酰基呋喃这1种化合物；氮杂环类包括吡啶、烟碱、吲哚等8种化合物。分类计算实验组与对照组7类致香成分的含量，结果见表1.6。
表1.6 实验组和空白组烟叶样品各类致香物质检测结果表 单位：μg/g
如表1.6所示，卷烟中添加了二年残孔菌胞外多糖后，香味物质的种类和含量都表现出不同的结果，这说明多糖成分对烟叶内部的香味物质有一定的影响，酚类香味成分增加明显，增加了19.67%，达到了143.31μg/g，而已知酚类物质对烟叶颜色有显著的影响，同时，多酚类在烟草燃吸时会产生酸性反应，能中和部分碱性物质，使吃味醇和；酯和内酯类单位含量增加了5.52%，达到了134.42μg/g，一些高级脂肪酸的甲酯和乙酯可以使烟叶香味变得醇和，这与烤烟香气协调，对烟草的吸食品质有重要影响。
醇类、醛类、呋喃类、氮杂环类含量则表现出下降趋势，实验组中酮类物质下降了5.28%，推测可能是多糖与烟草固有成分发生复杂化学反应的结果；实验组中醇类物质下降了7.21%；实验组醛类香味物质含量为49.22μg/g，下降了2.51%，醛类有愉快的、多半是强烈的香气，但是稳定性差，易发生氧化聚合，使香气减弱变坏，而实验组中醛类香味物质含量的下降说明胞外多糖的添加对该物质在烟草中积累有所影响；实验组氮杂环类物质含量为136.80μg/g，与空白组比较，含量下降了98.91%，氮杂环类物质种类较多，对烟草吸食品质影响也较大；呋喃类香味物质含量下降了2.89%，小范围评吸实验也表明多糖的加入对吸食品质有较大影响，口感发涩，但香味相对浓厚。
二年残孔菌胞外多糖的加入对烟叶内部香味物质的种类和含量有很大的影响，加入EPS后酯和内酯类、酚类的含量则表现出上升趋势，其中酚类物质增加明显，酮类、醇类、醛类、呋喃类、氮杂环类的含量表现出下降趋势，其中醇类、氮杂环类含量下降明显。可以减轻烟气刺激性、改善和修饰卷烟香气，进而提高烟气整体品质。真菌胞外多糖的加入显然对香味物质的变化有着深刻的影响，而其中具体的变化机理有待进一步探究。