2 表面活性剂和有机溶剂处理对真菌胞外多糖结构和生物活性的影响分析
寻找液体发酵的最适条件、进一步降低液体发酵的成本并提高目标产物的得率，是从事液体发酵的研究人员研究液体发酵的一个重要方向，并试图采用不同的方法来实现这一目标。目前，已有在液体发酵过程中添加表面活性剂和有机溶剂提高真菌胞外多糖产量的报道。
有机溶剂是一类分子质量较小的有机化合物，在常温下通常以液体状态存在，被广泛应用于生活和生产中。有机溶剂由于价格相对便宜且通过蒸发即可消失，故添加到真菌发酵液中，可提高次级代谢产物的积累，Lim等人发现在发酵对数期后期添加0.3%（体积分数）的甲苯可延长发酵时间，从而提高金钱菌（Collybia maculata）胞外多糖的产量，但目前该方面的报道太少。
表面活性剂是分子中含有亲水基和亲油基的一类试剂，即双亲结构的有机化合物。表面活性剂在溶液表面呈定向排列，造成液体表面张力的显著下降。表面活性剂具有乳化和扩散功能，因此，在发酵过程中添加一定量的表面活性剂可以起到乳化油脂的作用，同时对气液表面状态和发酵液的流动性也有一定的改进作用，促进细胞内外气体和营养物质的交换，使氧及营养物质更容易进入细胞，提高细胞膜的通透性，从而加大目标产物的产量。目前，表面活性剂作为一种发酵促进剂成为研究的一大热点，主要应用于工业领域，如通过发酵法获得酶制剂、氨基酸、新型材料等。在发酵液中添加表面活性剂对细胞生长具有一定的影响，但由于表面活性剂本身具有一定的毒性，对细胞生长有毒副作用，故添加量不能太大。在一定的浓度范围内，表面活性剂能够促进细胞的生长；但浓度过高会使发酵液中菌体密度降低，获得的细胞干重有所降低，且随着浓度增加，细胞干重减少也加快。有报道称，添加吐温80对细胞生长有一定的抑制作用，浓度越高对细胞生长的抑制作用越大。当表面活性剂的浓度超过0.1%时对细胞具有明显的抑制作用，导致生物量水平过低；但添加0.05%的吐温80，生物量降低幅度不大，细胞在这样的环境下也能较好地生长。
本工作采用二年残孔菌和虎皮香菇为研究对象，具体研究内容如下：
（1）在单因素试验的基础上，采用统计学方法和非统计学方法进一步研究二年残孔菌和虎皮香菇在发酵罐深层培养中产胞外多糖的最优培养条件，包括碳源、氮源等培养基成分及表面活性剂和有机溶剂等，并考察不同发酵时期的流变学与形态学，分析二者与胞外多糖产量之间可能存在的关系。
（2）表面活性剂和有机溶剂对胞外多糖产量和结构的影响 优选提高真菌胞外多糖产量的表面活性剂和有机溶剂，精制（除蛋白）收集的胞外多糖，使用层析柱纯化，检测其单糖组成，空间结构，并测定多糖的相对分子质量，探究表面活性剂和有机溶剂对两种真菌发酵产胞外多糖结构的影响。
（3）表面活性剂和有机溶剂对胞外多糖的生物活性的影响 采用多种方法测定胞外多糖的抗氧化活性、抗肿瘤能力等生物活性，研究表面活性剂和有机溶剂对两种真菌发酵产胞外多糖的生物活性的影响。
实验流程如图2.1所示：
图2.1 实验流程图
主要研究结果如下：
二年残孔菌产EPS最佳摇瓶培养条件：40g/L麦芽糖，8g/L蛋白胨，5mmol/L KH2PO4，培养时间8d，pH 5；在此基础上，选用C/N比、通气率和搅拌速度三个因素，应用旋转单一法优化发酵罐培养条件。结果表明，当C/N比为18.33，通气率为0.67vvm，搅拌速度为50r/min时，EPS产量达13.09g/L，且黏度与EPS产量和菌丝生物量有显著相关性。在最优摇瓶培养条件下，第6天添加表面活性剂吐温80和有机溶剂丙酮，EPS产量分别达7.21g/L和9.54g/L；Sepharose CL－6B凝胶柱层析表明两种EPS均为单一组分；红外光谱分析表明处理前后均为吡喃型糖；气相色谱分析表明处理前后单糖种类和含量均发生了变化，对照EPS含有8种单糖，丙酮处理的EPS含有7种单糖，吐温80处理后含有8种单糖；热重分析发现EPS经吐温80和丙酮处理后多糖发生热裂解反应；刚果红实验结果表明吐温80和丙酮处理后EPS可能具有三股螺旋结构，对照EPS无三股螺旋结构；凝胶层析法测定分子质量发现，未处理的EPS分子质量为22.1ku，吐温80处理的EPS分子质量为40.5ku，而丙酮处理的EPS分子质量为55.0ku；不同条件下EPS的抗氧化和抗肿瘤活性测定表明，丙酮和吐温80处理后的EPS抗氧化活性和抗肿瘤活性均有了显著提高，多糖浓度为10g/L时，丙酮处理后的EPS羟基自由基清除率为63.23%，DP P H自由基清除率为44.26%；多糖浓度为400μg/mL时，吐温80处理的EPS对Hepg 2细胞的抑制率极显著增加（P＜0.01），最大抑制率达到33.45%，比对照提高了156%，丙酮处理的EPS对MG63细胞的抑制率显著增加（P＜0.05），最大抑制率为20.95%，比对照提高72.85%。
虎皮香菇产EPS最佳摇瓶培养条件：60g/L乳糖，4g/L酵母粉，培养时间12d，pH8。运用均匀设计法优化其发酵罐扩大培养的C/N比、通气率和搅拌速度三个因素。结果表明，当C/N比为25，搅拌速度为202r/min，通气率为1.5vvm时，EPS产量为56.58g/L，且发酵液黏度与菌丝形态和多糖产量有一定的相关性。发酵第8天往优化培养基中添加表面活性剂吐温80和有机溶剂丙酮，EPS产量分别为12.29g/L和20.83g/L。红外光谱和气相色谱分析可知，经吐温80和丙酮处理后，虎皮香菇EPS均为β－D－型酸性杂多糖，且单糖组分发生明显变化；吐温80处理后其EPS含有4种单糖组分。刚果红实验表明，虎皮香菇经吐温80和丙酮处理后构象发生变化，其胞外多糖表现为明显的三股螺旋结构。热重分析发现，经丙酮和吐温80处理后虎皮香菇EPS的失重率有一定变化，吐温80处理后的EPS热稳定性比经丙酮处理得好。分子质量测定表明，未经处理的EPS分子质量为12.0ku，吐温80处理的EPS分子质量为22.1ku，丙酮处理的EPS分子质量为137.0ku。EPS生物活性测定表明，经丙酮和吐温80处理后，虎皮香菇的EPS抗氧化和抗癌活性有显著提高，当多糖浓度为10g/L时丙酮处理EPS羟基自由基清除率为29.26%；当多糖浓度为8g/L时，丙酮处理的EPS DPPH自由基的清除率达到63.08%，比对照提高近2倍。丙酮处理的EPS浓度为400μg/mL时，对Hepg 2细胞的抑制率显著增加（P＜0.01），达到22.85%，比对照提高134%；丙酮处理的EPS对MG63细胞的抑制率为25.29%，比对照提高135%。
上述研究成果提出两种真菌在发酵罐深层培养中产生胞外多糖的最优培养条件，包括碳源、氮源等培养基成分及表面活性剂和有机溶剂等，对胞外多糖的生产以及提取纯化过程具有重要的指导意义。同时，研究表面活性剂和有机溶剂对胞外多糖结构和生物活性的影响，为生物医药领域提供重要科学依据，具有重要的学术价值和应用前景。