3.2 马勃状硬皮马勃胞外多糖

3.2.1 液体深层发酵条件的优化及形态学研究

（1）菌种及培养基 马勃状硬皮马勃：菌种由西南科技大学贺新生教授提供，由野生子实体经组织分离获得。PDA培养基：200g去皮土豆，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1000mL，pH自然；不加琼脂为PDA培养液。

基础培养基：30g/L葡萄糖，3g/L蛋白胨，装液量为50mL/250mL锥形瓶，pH自然。

（2）实验方法 菌种发酵条件的优化过程及形态学研究方法同3.1.1。

（3）最适生长周期的确定 在12d培养时间内，每2天测量一次马勃状硬皮马勃的菌丝体和EPS产量，用Sigmaplot软件作图，结果如图3.21所示。随着培养时间的延长，马勃状硬皮马勃的菌丝体和EPS产量均有所增加，但第10天以后菌丝体产量仍在增加，而EPS产量却明显下降，这可能是由于菌丝体达到生长高峰期后，碳源不足，马勃状硬皮马勃自身产的多糖作为养分供应菌丝增长而被消耗。此外，马勃状硬皮马勃在液体培养时，随着菌丝体大量生长，培养液呈黏稠状，到第12天已经呈糊状，不利于菌丝体和胞外多糖的分离。因此确定马勃状硬皮马勃的生长周期为10d，此时胞外多糖的产量最高。

（4）单因素实验结果 碳源、氮源和无机盐对马勃状硬皮马勃的菌丝体和EPS产量的影响如图3.22所示。分析图3.22（1）可知，马勃状硬皮马勃对葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖均能良好通化利用，以蔗糖为碳源时菌丝体产量最高；但果糖为碳源得到的EPS产量略高于蔗糖。本实验以EPS产量为最终观测目标，综合考虑确定最佳碳源为果糖。由于果糖的市场价格比蔗糖高，企业大规模生产时考虑到成本因素可以选择蔗糖。如图3.22（2）所示，以大豆粉为氮源时，马勃状硬皮马勃的菌丝体和EPS产量均最高，其次是酵母粉；相对于几种有机氮源，测试的无机氮源不利于菌丝生长和EPS产生。综合考虑，确定最佳氮源为大豆粉。如图3.22（3）所示，添加无机盐可以提高EPS产量，但添加氯化钠和硫酸亚铁降低了菌丝体产量。添加KH₂PO₄时真菌的菌丝生物量和EPS产量均有显著增加，而添加MgSO₄时EPS产量增加最大，故选择KH₂PO₄和MgSO₄进一步优化培养基组成。

选取5个温度梯度22℃、24℃、26℃、28℃和30℃进行发酵培养，测定菌丝体和EPS产量，结果如图3.23（1）所示。可以看出，24℃培养时马勃状硬皮马勃的菌丝体产量最高，而EPS产量在26℃最大，随着温度的升高EPS产量降低。综合考虑菌丝体和EPS产量，确定26℃为最适宜培养温度。培养基中pH的变化对营养物质的吸收与利用、细胞的生长、EPS产量都有着很大的影响。pH对测试真菌菌丝体生长和EPS产量的影响如图3.23（2）所示。可以看出，马勃状硬皮马勃菌丝体生长的最适pH为6.0，产胞外多糖的最适pH为8.0。

（5）正交实验 在单因素试验的基础上，选用适宜碳源（果糖）、氮源（大豆粉）和无机盐（KH₂PO₄+MgSO₄）三个因素，采用L9（3⁴）正交设计优化了试验真菌产EPS的摇瓶培养条件。优化马勃状硬皮马勃培养基的因素和水平见表3.7，正交试验结果如表3.8所示。

如表3.7所示，以EPS产量为指标，影响因素的主次顺序为氮源＞碳源＞无机盐，最优组合均为B₂A₁C₂，即马勃状硬皮马勃的最佳培养基组合为20g/L果糖，5g/L大豆粉，2.5mM/L KH₂PO₄，2.5mM/L MgSO₄，获得的最大EPS产量为2.627g/L。

（6）马勃状硬皮马勃形态和黏度研究结果 马勃状硬皮马勃液体培养菌丝体的形态如图3.24所示（由于优化培养基中菌丝体生长快速，发酵后期菌丝体黏稠致密，仅拍摄了第2天的菌丝体形态）。可以看出马勃状硬皮马勃的菌丝体分枝状生长，表面光滑，且少见空泡，锁状联合较少。

培养时间对发酵液黏度和pH的影响见图3.25。可以看出，随着培养时间的延长，发酵液的黏度显著增加［图3.25（1）］，表明胞外多糖溶液是典型的非牛顿流体。与多数大型真菌人工培养相似，随着培养时间的延长，马勃状硬皮马勃发酵液的pH明显降低［图3.25（2）］。丝状真菌发酵形态会直接影响发酵液的流变性能，特别是在高黏度发酵的时候。最开始的发酵液一般为牛顿流体，随着菌丝体的增长，菌丝体间发生相互缠绕与粘连，菌丝体生物量的细微变化即可引起发酵液黏性的迅速增加，发酵液在后期表现为非牛顿流体。马勃状硬皮马勃在优化的培养条件下快速生长，EPS产量增加，且可产生大量无性孢子，可能是造成其液体培养呈片层状而不是菌球状群体形态的原因，也造成培养液的黏度随着培养时间的延长而明显增加。较高的黏度显示马勃状硬皮马勃的胞外多糖有良好的流变学特性，具备作为食品添加剂的开发应用潜力。

（7）小结 马勃状硬皮马勃产EPS的最优环境条件为温度26℃、pH8、摇床转速160r/min，最适生长周期为10d，最佳碳源、氮源和无机盐分别是果糖、大豆粉、KH₂PO₄和MgSO₄。正交试验优化的产EPS的最佳培养基组合为：20.0g/L果糖，5.0g/L大豆粉，2.5mmol/L KH₂PO₄，2.5mmol/L MgSO₄。在优化培养基下，马勃状硬皮马勃EPS产量为2.627g/L。

在摇床优化培养基中，马勃状硬皮马勃的菌丝体呈分枝状生长，群体呈片层状而不是多数丝状真菌的菌球状；发酵液黏度与培养时间正相关，较高的黏度表现出良好的流变学性质，使其EPS具有作为食品添加剂开发利用的潜力；与多数大型真菌类似，其发酵液pH与培养时间呈负相关。

3.2.2 胞外多糖的分离纯化及分子结构的测定

（1）多糖的提取及精制 提取及精制方法同3.1.2。五种碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS的纯化结果如下图3.26至图3.30所示，通过分析可知，以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖为碳源制得的粗多糖纯化时均有两个峰，即两个组分。以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖为碳源发酵得EPS的蛋白吸收峰出在多糖吸收峰的第二个峰处，说明精制多糖的第二个组分可能含有部分糖蛋白；而以果糖为碳源时，蛋白吸收峰在两个多糖吸收峰中都有，说明其精制多糖的两个组分可能均含有糖蛋白。与不同碳源发酵杨树桑黄产EPS纯化结果相同的是，以麦芽糖为碳源时，发酵马勃状硬皮马勃得EPS纯化出来的第一个组分的吸收峰较其他碳源发酵得EPS纯化的第一个组分的吸收峰相比明显小很多，说明其第一个组分的多糖含量比较少。不同碳源发酵马勃状硬皮马勃制得的粗多糖精制组分的收集管数大致相同，以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖分别为碳源时，精制多糖组分的收集管数分别为Fr－Ⅰ13～35管，Fr－Ⅱ36～45管；Fr－Ⅰ14～35管，Fr－Ⅱ36～45管；Fr－Ⅰ13～35管，Fr－Ⅱ 36～45管；Fr－Ⅰ 13～31管，Fr－Ⅱ 32～50管；Fr－Ⅰ13～31管，Fr－Ⅱ32～50管。其中以麦芽糖和乳糖为碳源时，发酵得EPS的第一个组分吸收峰比较靠前，说明其分子质量较大，较先被洗脱出来。

（2）EPS的红外光谱测定 不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ的红外光谱图如图3.31所示，通过红外分析我们可以得知，其结构存在相似性，EPS的分子氢键均以分子间氢键为主，均有磺酰基—O—SO₂—R、酰胺基和C—O—C环内醚结构。但分子结构也有一定的差异性，其中以麦芽糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ无吡喃环末端次甲基的横摇振动，而其他四种碳源均有。其分子连接方式以及分子构型存在一定相似性，均为α－吡喃型酸性杂多糖，并含有甘露糖的特征吸收峰。综合分析可知，不同碳源对马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ的分子结构有一定影响。

不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ的红外光谱图如图3.32所示，其结构存在相似性，胞外多糖的分子氢键均以分子间氢键为主，均有磺酰基－O－SO₂－R、酰胺基以及—COOH官能团。但不同碳源对其分子连接方式以及分子构型存在显著影响，其中以葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ为α－甘露吡喃型酸性杂多糖，而以蔗糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ为β－甘露吡喃型酸性杂多糖。经分析可知，不同碳源对马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ的分子结构有一定影响。

（3）不同碳源发酵杨树桑黄和硬皮马勃产EPS的GC/MS分析 采用面积归一化法对不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS精制组分进行分析，分析结果如表3.9所示，其单糖组分主要包括阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸。以葡萄糖和乳糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ均不含阿拉伯糖和鼠李糖，其Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ所含单糖组分和含量：核糖10.40%和5.71%，3.23%和4.36%、木糖5.66%和2.21%，3.67%和6.56%、葡萄糖醛酸40.13%和5.79%，49.68%和34.33%、半乳糖6.81%和10.15%，0.57%和2.76%、葡萄糖4.60%和1.88%，3.24%和11.90%、甘露糖30.09%和43.21%，38.92%和35.55%，半乳糖醛酸2.31%和11.05%，0.69%和4.54%；以蔗糖和果糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ均不含阿拉伯糖，其Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ所含单糖组分和含量：鼠李糖0.33%和3.65%，0.86%和1.99%、核糖4.01%和6.94%，5.35%和8.36%、木糖5.84%和5.54%，9.81%和3.77%、葡萄糖醛酸47.46%和22.94%，47.35%和35.05%、半乳糖4.72%和9.33%，2.21%和2.82%、葡萄糖4.53%和15.86%，4.21%和7.50%、甘露糖31.96%和22.15%，29.70%和33.79%、半乳糖醛酸1.15%和13.59%，0.51%和6.72%；以麦芽糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ均不含鼠李糖，其Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ所含单糖组分和含量：阿拉伯糖1.15%和2.14%、核糖3.39%和4.36%、木糖4.49%和9.18%、葡萄糖醛酸36.75%和25.48%、半乳糖1.84%和2.86%、葡萄糖10.75%和15.47%、甘露糖33.34%和25.47%、半乳糖醛酸7.89%和15.04%。五种碳源发酵得EPS各精制组分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS可能为酸性多糖，与其红外光谱分析结果一致；其单糖组分中含量最多的是甘露糖，与红外光谱中出现810cm^－1处甘露糖的特征吸收峰一致。五种碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS所含单糖组分的种类和含量有显著的差别，尤其是鼠李糖和阿拉伯糖的含量。同一碳源发酵得EPS两种组分的单糖组分含量均不相同，说明碳源对液体发酵产EPS的单糖组分有一定影响。

（4）EPS的分子质量及分子构象分析 不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS的SEC/MALLS分析。

利用尺寸排阻色谱（SEC）、多角度激光光散射检测器（MALLS）及示差折光检测器（RI）连用技术，可检测不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS精制组分的分子质量，及其在水溶液中的分布情况，结果详见表3.10。

分析表3.10可知，以葡萄糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS精制组分的重均分子质量分别为5.629×10⁵和1.203×10⁵，M_w/M_n即多分散系数分别为4.538和3.067，表明两个组分的分散性均很低，即在水溶液中很容易形成大量的聚集体，溶解度很小。以葡萄糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS精制Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ的均方根半径分别为34.4nm和8.7nm。Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ的均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率分别为0.28和0.15（如图所示），说明其在水溶液中以球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚合体。通过SEC/MALLS测得不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS各精制组分的分子质量均大于第三章中凝胶过滤法测得的分子质量，这可能是因为精制多糖经过透析后发生了聚集，溶解度降低所致。以蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖为碳源发酵得EPS的多分散性也很低，溶解度很小，其均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率均小于0.3，可知其在水溶液中均以球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚合体。出现这种现象的原因，可能是在进行透析时多糖分子发生聚集所致。不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS精制组分Fr－Ⅰ（左）和Fr－Ⅱ（右）的均方根半径对分子质量的双对数曲线如图3.33至图3.37所示。

（5）不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS的分子构象分析 不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS分子构象的参数如表3.11所示，其中M_w和R_g值通过SEC－MALLS法测得，而R_h通过黏度法获得，根据Einstein理论公式推算得。黏度由乌氏黏度计测定，它反映了在稀溶液中多糖所占的水力体积。通常认为，黏度越小，多糖往往具有比较致密的构象。如表3.11所示，不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS的黏度有一定差异，实验测得以葡萄糖为碳源时发酵得EPS Fr－Ⅱ的黏度值最小，而且其分子质量和均方旋转半径较其他EPS的小，尤其是均方旋转半径非常小，说明其链未舒展开，结构较为致密。

k′值在0.3～0.5之间时，表明该溶液对聚合物是良溶剂。由表3.11可见，不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS各精制组分的k′均大于0.5，说明其在水溶液中的溶解性较低。R_g和R_h的比值为ρ，ρ值可以用来描述多糖分子在水溶液中的链构象，ρ～0.8时，为均一紧密的球形构象；ρ～1.0时，为一个松散连接的超支化链或聚合物；ρ～1.5时，为无规则卷曲的链团；ρ～1.5时，为扩展的刚性链。分析结果可知，以葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖发酵得EPS各精制组分的ρ值均接近于1，说明其EPS各精制组分在水溶液中可能为高度分支的多糖聚集体。

（6）小结 五种碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ均为α－吡喃型酸性杂多糖，并含有甘露糖的特征吸收峰。以葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ为α－甘露吡喃型酸性杂多糖，而以蔗糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ为β－甘露吡喃型酸性杂多糖。EPS精制组分的单糖组分主要包括阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸，其种类和含量有显著的差别，尤其是鼠李糖和阿拉伯糖的含量。EPS各精制组分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS可能为酸性多糖。

SEC/MALLS测得其EPS各精制组分的分子质量均大于第三章中凝胶过滤法测得的分子质量，多分散性也很低，溶解度很小，均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率均小于0.3，可知其在水溶液中均以球形构象存在，是一种高度紧密且具有分支结构的多糖聚合体。通过黏度的测定分析k′和ρ值，可知其EPS精制组分在水溶液中的溶解性也较低，为高度紧密且具有分支结构的多糖聚合体的构象。

3.2.3 胞外多糖的抗氧化活性

（1）不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS对·OH的清除率 不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS对·OH的清除率结果如图3.38所示，可以明显看出碳源对其抗氧化活性有显著影响，而且随着粗EPS浓度的增加，对·OH的清除率直线升高。不同碳源发酵得粗EPS对·OH的清除能力大小为果糖＞乳糖＞蔗糖＞麦芽糖＞葡萄糖。以果糖为碳源发酵得EPS浓度为10mg/mL时，其对·OH自由基的清除率高达22.65%；而以乳糖、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖为碳源发酵得粗EPS浓度为10mg/mL时，对· OH自由基的清除率分别为18.87%、16.69%、14.86%、13.66%。可以看出，不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS对·OH的清除率远远小于不同碳源发酵杨树桑黄产EPS对·OH的清除率，而且通过前面分析可知，马勃状硬皮马勃EPS的黏度均较杨树桑黄EPS的高，说明可能具有较高黏度多糖的抗氧化活性较低，研究发现黏度过高不利于多糖药物的扩散与吸收，如裂褶多糖因黏度大而无法在临床上应用，后来在不破坏其结构的基础上使其降解，从而使黏度降低，最终其生物利用率大大提高。通过前面单糖组分分析可知，以葡萄糖为碳源发酵得EPS所含单糖组分种类最少，不含阿拉伯糖和鼠李糖，其对·OH的清除能力也最低，说明单糖组分的种类可能也对抗氧化活性有影响，种类越多的杂多糖表现出越好的抗氧化活性。

（2）不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS对·DPPH的清除率 不同碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS对·DPPH清除率的结果如图3.39所示，其对·DPPH的清除能力大于其对·OH的清除能力，清除能力大小为果糖＞乳糖＞蔗糖＞葡萄糖＞麦芽糖，该顺序与对·OH清除率的大小基本一致。以果糖为碳源发酵获得EPS浓度为5mg/mL时，其对·DPPH的清除能力已经高达41.32%，以乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源发酵得EPS浓度为5mg/mL时，对·DPPH的清除能力分别为33.53%、31.10%、25.77%、20.23%。以麦芽糖为碳源发酵得EPS对· DPPH的清除率小于以葡萄糖为碳源发酵得EPS对·DPPH的清除率，该结果与对·OH的清除率结果相反，可能是因为以麦芽糖为碳源发酵得EPS的分子质量较大，抗氧化活性低。通过SEC/MALLS可知，以果糖为碳源发酵得EPS分子质量相对较低，有利于跨越多重细胞膜阻碍进入生物体内结合活性位点发挥其生物活性，因此其对·DPPH的清除能力最强。