3.1 杨树桑黄胞外多糖

3.1.1 液体深层发酵培养条件的优化及形态学研究

自真菌多糖的药用价值被发现以来，我国就开始研究真菌的栽培技术，主要以固体栽培技术为主。然而固体栽培的生长周期长，占地面积广，劳动强度大，受季节环境影响等因素的制约，很难实现产业化生产。因此发酵法生产真菌多糖成为目前发展的大趋势，其中液体深层发酵培养具有培养时间短，节约资源，产率高，生产过程易于控制，培养基丰富，菌丝体易于分离等优点，可实现工业化生产。

而且研究发现液体深层发酵培养获得的胞外多糖与从子实体提取的多糖具有相似的生物活性，但其高产率是子实体多糖无可比拟的。陆正清研究表明，液体深层发酵灵芝，其菌丝体中粗多糖和多糖含量分别为子实体的2.26倍和3.5倍，目前液体深层发酵法已被广泛用于真菌多糖的发酵提取。真菌发酵生产可以产生大量有用的代谢产物，广泛用于医药、食品行业，产生巨大的经济和社会价值。其在发酵过程中的菌丝体形态对菌丝体的生理活性状态及代谢产物的积累非常重要，因此为了得到最佳产物目标，需要研究发酵条件与菌丝体形态之间的关系。

本工作利用摇床发酵培养两种真菌，以EPS产量为指标，对其培养基（碳源、氮源、无机盐）和培养条件（温度、pH）进行优化，并在最佳培养条件下研究其形态学特征，为后期的发酵罐培养奠定基础。

（1）菌种及培养基

①菌种：

a.杨树桑黄：菌种来自郑州轻工业学院发酵工程研究室，于斜面培养基上置4℃冰箱中保存。

b.马勃状硬皮马勃：菌种由西南科技大学贺新生教授提供，由野生子实体经组织分离获得。

②培养基：

a.PDA培养基：200g去皮土豆，20g葡萄糖，20g琼脂，加蒸馏水至1000mL，pH自然；不加琼脂为PDA培养液。

b.基础培养基：30g/L葡萄糖，3g/L蛋白胨，装液量为50mL/250mL锥形瓶，pH自然。

（2）实验方法

①菌种活化：挑取冰箱中保存的试管斜面菌种到P DA平板上，置于电热恒温培养箱（26℃）中培养7d。

②种子液的制备：用打孔器取平板边缘新生菌丝两块，接入含50mL种子培养液的250mL锥形瓶中，于转速设定为160r/min、温度为26℃的摇床中培养4d。然后加入灭菌磁珠和玻璃珠，置于磁力搅拌器上将菌丝球打碎后备用。整个实验过程中的接种量均为4%（体积分数）。

③制作葡萄糖标准曲线：准确称取于105℃烘箱中干燥至恒重的葡萄糖标准品0.255g，加蒸馏水溶解后，转移至100mL容量瓶中定容，即为葡萄糖标准母液；移取1mL母液移至100mL容量瓶中定容，即为葡萄糖标准液。

分别吸取葡萄糖标准液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL置于试管中，补蒸馏水至1mL，再各加入5%的苯酚1mL和浓硫酸5mL，涡旋振荡混匀，然后沸水浴15min，取出后再冰水浴15min。以加入0mL葡萄糖标准液的反应液作为空白对照调零，于490nm下测各反应液的吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，反应液吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

④菌丝体和EPS产量的测定：采用抽滤法分离菌丝体和发酵液，将滤纸和菌丝置于70℃烘箱中烘干后称量，减去滤纸重即为菌丝干重。菌丝体产量的计算公式如下：

将发酵液旋转蒸发浓缩至100mL左右，浓缩液加入4倍体积95%乙醇，4℃静置过夜，然后10000r/min离心15min，得到的粗多糖沉淀用蒸馏水溶解并定容至250mL，然后用苯酚硫酸法测定其多糖含量。

⑤最适生长周期的确定：将两种真菌分别培养14d，每隔2天测定其菌丝体和EPS产量。

⑥单因素试验确定最佳摇瓶培养条件：

a.碳源优化试验：分别用蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、木糖代替基础培养基中的葡萄糖，26℃、160r/min培养，测其菌丝体和EPS产量。

b.氮源优化试验：分别用牛肉膏、玉米粉、胰蛋白胨、大豆粉、酵母粉、尿素、（NH₄）₂SO₄、NaNO₃代替基础培养基中的蛋白胨，26℃、160r/min培养，测其菌丝体和EPS产量。

c.无机盐优化试验：在基础培养基中分别添加5mM的MgSO₄、KH₂PO₄、CuSO₄、NaCl、CaCl₂、FeSO₄，以不加无机盐的作为对照，26℃、160r/min培养，测其菌丝体和EPS产量。

d.pH试验：使用1mol/L的HCl和NaOH调节基础培养液pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，26℃、160r/min培养，测其菌丝体和EPS产量。

e.温度试验：采用基础培养基，接种后分别进行22、24、26、28、30和32℃ 160r/min培养，测定其菌丝体和EPS产量。

f.正交试验：在单因素实验的基础上，采用正交试验优化两种真菌在摇瓶培养中获得最高EPS产量的条件。为了综合确定培养基中碳源、氮源和无机盐的最佳浓度组合，本实验设计了L9（3⁴）正交表。

g.形态学和黏度研究：每两天取一次优化培养基培养的菌丝体，显微镜下拍摄其形态并测定培养液的黏度和pH。菌丝体进行显微观察前，先加入与发酵液等体积的固定剂和少许染色剂，4℃放置1d，然后用蒸馏水将菌丝体冲洗干净，晾干后备用。菌丝球的紧密度、粗糙度通过DT2000图像分析软件分析，利用平均直径、菌核面积、菌丝球面积、菌丝球周长、圆度等参数计算。公式如下所示：

紧密度＝菌核面积/菌丝球面积；粗糙度＝（菌丝球的周长）²/（菌丝球面积×4π）。

测定发酵液黏度时应先将样品混合均匀，选择合适的转子及转速。样品黏度＝黏度计读取数值×相对应转子系数。相关系数与使用的转子、转速之间的关系如表3.1所示。

（3）最适生长周期的确定 在发酵培养期间，每2天取一次样，测量杨树桑黄菌丝体和EPS产量，用sigmaplot软件作图，结果如图3.2所示。随着培养时间的增加，杨树桑黄的菌丝体和EPS产量均显著增加，但第8天以后菌丝体产量仍在增加，EPS产量却明显下降。出现这种现象的原因可能是由于菌丝体达到一定生长高峰期后，碳源不足，产生的多糖逐渐作为养分供应菌丝增长而被消耗。本实验以EPS产量为观测指标，因此确定杨树桑黄的生长周期为8d，此时EPS产量达到最高。

（4）单因素实验结果 如图3.3所示，碳源、氮源和无机盐对杨树桑黄的菌丝体和EPS产量均有显著影响。如图3.3（1）所示，杨黄对葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖的利用率较高，以葡萄糖为碳源时菌丝体产量最高，但当EPS产量低于以蔗糖为碳源时，杨树桑黄摇瓶发酵的最佳碳源为蔗糖。由图3.3（2）可知，以玉米粉为氮源时，杨黄的菌丝体和EPS产量均达到最大值，其次是酵母粉，这与李延生研究的瓦尼木层孔菌的培养特性结果一致。并且研究表明无机氮源不利于菌株的生长，有机氮源利于菌株的生长和胞外多糖的积累，本实验结果与其一致。

因此杨树桑黄发酵的最佳氮源为玉米粉。在培养基中添加适量的无机盐，可以增加菌丝体和EPS产量。如图3.3（3）所示，添加无机盐较没有添加无机盐的EPS产量高。当添加MgSO₄时杨黄的菌丝生物量达到最大，但添加KH₂PO₄时，EPS产量显著增加，故选择KH₂PO₄作为最适宜生长的无机盐添加应用。

培养基中pH的变化对真菌营养物质的吸收与利用、细胞的生长、EPS产量都有着很大的影响。以液体种子培养基为基础培养基，其他条件保持不变，调节培养基pH分别为3、4、5、6、7、8，进行发酵培养，确定最适pH，结果如图3.4（1）所示。可以得出，当培养基pH为7.0时，杨树桑黄产胞外多糖的产量最高。选取5个温度梯度，24℃、26℃、28℃、30℃、32℃对杨树桑黄进行发酵培养，测定其菌丝体和EPS产量。由图3.4（2）可以看出，26℃时杨树桑黄的菌丝体产量最高，随着温度的升高，菌丝体产量没有明显变化；EPS产量在28℃时增加至最大值，然后随着温度的升高EPS产量降低，因此选取28℃为最佳培养温度。

（5）正交实验结果 根据上述单因素实验结果，碳源选择蔗糖，氮源选择玉米粉，无机盐选择KH₂PO₄，设计L9（3⁴）正交表进行正交试验优化杨树桑黄产EPS的最佳培养基组合。各因素和水平详见表3.2，正交试验结果如表3.3所示。

如表3.3所示，以菌丝体和EPS产量为指标，影响因素的主次顺序均为A＞C＞B，最优组合为A₃C₁B₃。如表3.3所示的9组实验组合中没有最优组合为A₃C₁B₃，因此选择该组合进行追加实验，获得最佳条件下的胞外多糖产量为0.352g/L。杨树桑黄的最优培养基组合为40g/L蔗糖，4g/L玉米粉，4mmol/L KH₂PO₄，获得的胞外多糖产量为0.352g/L。

（6）杨树桑黄形态学结果 在优化培养基中，不同发酵时间的杨黄菌丝球形态变化和菌丝球平均直径、圆度、紧密度和粗糙度的变化分别如图3.5和图3.6所示。如图3.5所示，随着培养时间的增加，菌丝球逐渐增大，第2天已有明显的菌核，外围菌丝持续生长。到第6天菌丝生长最旺盛，发酵后期菌核较为致密，菌丝逐渐减少，这可能是由于发酵后期，菌丝生长到了稳定期。菌丝球的直径和紧密度随着时间的延长均逐渐增加［图3.6（1）和图3.6（3）］，圆度呈先增加后减小的趋势，初期圆度小可能与发酵初期菌丝球为丝状体有关，随着发酵时间的增加，外围菌丝增加圆度急剧下降［图3.6（2）］。如图3.6（4）所示可知，菌丝球的粗糙度先减小后增加，与圆度呈负相关。

（7）小结 通过单因素实验确定了杨树桑黄产EPS的最优环境条件为温度28℃、pH7、摇床转速160r/min，最适生长周期为8d，最佳碳源、氮源和无机盐分别是蔗糖、玉米粉和KH₂PO₄。正交试验优化杨树桑黄的最佳培养基组合为40g/L蔗糖，4g/L玉米粉，4mmol/L KH₂PO₄，获得的最大胞外多糖产量为0.352g/L。

在摇床优化培养基中，杨树桑黄菌丝球随着培养时间的延长逐渐增大，其平均直径、紧密度均逐渐增加，圆度先增加后急剧减小，粗糙度与圆度呈负相关，表现为先减小后增加的趋势。

3.1.2 胞外多糖的分离纯化及分子结构的测定

（1）多糖的提取及精制

①不同碳源发酵罐发酵两种真菌：根据优化结果，选取两种真菌均能较好利用的五种碳源，即葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖，进行发酵罐培养。5L发酵罐中加入3.5L的发酵罐培养液，放入立式灭菌锅中灭菌后立即放置到发酵罐设备上，待冷却到设定温度后接入4%的种子液。搅拌速度设定为150r/min，进气量为2vvm。

②提取发酵液中多糖：利用抽滤法分离菌丝体和发酵液，将所得发酵液旋转蒸发浓缩至100mL左右，加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，然后10000r/min离心15min，得到粗多糖沉淀。

③Sevag法除蛋白：在所得粗多糖沉淀中加入适量的蒸馏水，使其完全溶解，得到粗多糖沉淀。配制氯仿/正丁醇（5∶1）（体积比）混合液，即除蛋白液。加入1/3多糖溶液的除蛋白液，置于磁力搅拌器上搅拌30min，然后于分液漏斗中静置20min，除去下层的有机相，留下水相，重复4～5次，直至有机相与水相间无明显沉淀为止。

将所有水相旋转蒸发浓缩至100mL左右，加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，然后10000r/min离心15min，得到粗多糖沉淀。然后将多糖沉淀冷冻干燥，即得粗胞外多糖。

④粗胞外多糖的分离纯化：利用Sepharose CL－6B层析柱对粗胞外多糖进行分离纯化，每次上样前需用0.2mol/L NaCl缓冲液冲洗Sepharose CL－6B层析柱。

称量20mg粗多糖，溶于2mL 0.2mol/L的NaCl缓冲液中，用0.22μm孔径的滤膜过滤后通过Sepharose CL－6B柱层析。调整恒流泵使洗脱液流速为1.15mL/min，利用自动收集器收集1～60管，每管5mL。从每管取1mL收集液，用苯酚硫酸法于490nm处检测多糖，然后于280nm处直接检测剩余收集液的蛋白，记录吸光度值。以管数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制粗多糖纯化图。重复过层析柱8～10次，根据纯化图将同一组分的多糖收集在一起，旋转蒸发浓缩后用截留分子质量为3500ku的透析袋透析3d，每天换蒸馏水3次。最后将透析过的精制胞外多糖冷冻干燥，置于干燥器中备用。

五种碳源发酵杨树桑黄产EPS的纯化结果如下图3.7至图3.11所示，通过分析可知，以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖为碳源制得的粗多糖纯化时均有两个峰，即两个组分（我们用Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ表示）。并且以葡萄糖、果糖、麦芽糖为碳源发酵得EPS的蛋白吸收峰出在多糖吸收峰的第二个峰处，说明精致多糖的第二个组分可能含有部分糖蛋白；而以蔗糖为碳源时，蛋白吸收峰在两个多糖吸收峰中都有，说明其精制多糖的两个组分均含有糖蛋白；以乳糖为碳源发酵得粗多糖的纯化仅有一个峰，说明为单一组分，且可能含有一定量的糖蛋白。以麦芽糖为碳源时，发酵得EPS纯化出来的第一个组分的吸收峰较其他碳源发酵得EPS纯化的第一个组分的吸收峰相比明显小很多，说明其第一个组分的多糖含量比较少。不同碳源发酵杨树桑黄制得的粗多糖精制组分的收集管数大致相同，以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖分别为碳源时，精制多糖组分的收集管数分别为Fr－Ⅰ13～28管，Fr－Ⅱ29～40管；Fr－Ⅰ12～28管，Fr－Ⅱ29～40管；Fr－Ⅰ12～28管，Fr－Ⅱ29～35管；Fr－Ⅰ14～24管，Fr－Ⅱ25～40管；单一组分25～40管。其中以麦芽糖为碳源时，发酵得EPS的第一个组分吸收峰比较靠前，说明其分子质量较大，较先被洗脱出来。

（2）精制EPS的红外光谱（IR）测定 称取2～3mg精制EPS，加入适量的KBr，研磨均匀后压片，用傅立叶变换红外光谱仪在4000～400cm^－1波长区间内扫描吸收。

不同碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ的红外光谱图如图3.12所示，通过分析可知，以不同碳源发酵杨树桑黄获得的胞外多糖Fr－Ⅰ其结构存在相似性，如这些胞外多糖的分子氢键均已分子间氢键为主，均有—COOH、磺酰基—O—SO₂—R、氨基或酰胺基。但是分子机构的差异性也很明显，它们含有的部分官能团、分子连接方式以及分子构型各不相同。如以蔗糖、果糖和麦芽糖为碳源发酵获得的胞外多糖有C—O—C环内醚结构，而以葡萄糖和乳糖为碳源发酵获得的胞外多糖没有此官能团。以葡萄糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为β－吡喃型的酸性杂多糖，以果糖和麦芽糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为α－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以蔗糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为α－、β－两种构型共存的甘露吡喃型酸性杂多糖，以乳糖为碳源发酵获得的EPS为酸性甘露聚糖。因此，我们可以得出，在相同条件下，使用不同碳源发酵培养杨树桑黄，获得的EPS Fr－Ⅰ的结构和糖的构型是不同的。

不同碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅱ的红外光谱图如图3.13所示，通过分析可知，以不同碳源发酵杨树桑黄获得的EPS Fr－Ⅱ的分子结构存在相似性，如它们都含有氨基或酰胺基说明发酵获得的多糖可能含有糖蛋白；其分子氢键均已分子间氢键为主，均有磺酰基－O－SO₂－R以及－COOH官能团。但是，分子机构的差异性也很明显，它们含有的部分官能团、分子连接方式以及分子构型各不相同。如以果糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ有C－O－C环内醚结构，而其他四种碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ没有此官能团。以麦芽糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ为β－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ为α－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以乳糖为碳源发酵获得的EPS为酸性甘露聚糖。通过分析可知，在相同条件下使用不同碳源发酵培养杨树桑黄，获得的胞外多糖Fr－Ⅱ的结构和糖的构型是不同的。

（3）精制EPS的气相/质谱（GC/MS）测定 称取精制EPS 3mg，放入棕色小瓶中，加入3mL 2mol/L的三氟乙酸，密封后置于121℃的烘箱中恒温2h。冷却后用0.22μm的水相过滤，滤液旋转蒸干，然滤膜后加入2－3mL甲醇再次蒸干，重复3次。加入1.5mL吡啶和0.1mL衍生试剂BSTFA∶TMCA（99∶1），密封后置于80℃的烘箱中恒温1h，冷却后过0.22μm的有机滤膜于气相小瓶中，送样检测。

上样条件：HP－5 MS 60m色谱柱，进样量0.1μL，分流比100∶1，延迟时间7min，进样口280，传输线280。升温程序：起始温度60℃，保持2min，以5℃/min的速度升温至280℃，保持20min。MS分析条件：溶剂延迟7min，扫描范围35～455aum，进样口280℃，传输线温度280℃，EI能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度160℃。

采用面积归一化法对不同碳源发酵杨树桑黄产EPS精制组分进行分析，分析结果如表3.4所示。以葡萄糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ含有的单糖组分和含量：鼠李糖0.71%、核糖0.57%、木糖1.73%、葡萄糖醛酸12.66%、半乳糖14.32%、葡萄糖17.2%、甘露糖35.48%和半乳糖醛酸17.34%，其Fr－Ⅱ不含鼠李糖和核糖，所含单糖组分和含量为木糖1.52%、葡萄糖醛酸19.53%、半乳糖3.03%、葡萄糖24.28%、甘露糖30.68%和半乳糖醛酸30.68%；以蔗糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ均不含鼠李糖，其Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ所含单糖组分和含量：核糖1.45%和1.92%、木糖2.52%和3.86%、葡萄糖醛酸40.31%和20.89%、半乳糖1.68%和7.09%、葡萄糖1.90%和14.79%、甘露糖50.24%和36.15%和半乳糖醛酸1.89%和15.32%；以果糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ不含鼠李糖，其Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ所含单糖组分和含量：鼠李糖0%和1.42%、核糖0.99%和1.22%、木糖2.53%和2.05%、葡萄糖醛酸43.15%和35.87%、半乳糖1.94%和2.77%、葡萄糖2.68%和7.77%、甘露糖46.07%和42.27%和半乳糖醛酸2.63%和6.63%；以麦芽糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ不含鼠李糖和核糖，其Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ所含单糖组分和含量：鼠李糖0%和3.00%、核糖0%和2.03%、木糖1.63%和5.21%、葡萄糖醛酸32.37%和20.92%、半乳糖3.87%和9.25%、葡萄糖7.05%和14.99%、甘露糖48.22%和29.4%和半乳糖醛酸6.86%和15.20%；以乳糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS所含单糖组分和含量：鼠李糖2.68%、核糖1.55%、木糖2.04%、葡萄糖醛酸26.60%、半乳糖5.11%、葡萄糖11.59%、甘露糖39.88%和半乳糖醛酸10.54%。五种碳源发酵得EPS精制组分都含有大量葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS可能为酸性多糖，与其红外光谱分析结果一致；其单糖组分中含量最多的是甘露糖，其次是葡萄糖，与红外光谱中出现810cm^－1和870cm^－1处甘露糖的特征吸收峰一致；其单糖组分中鼠李糖和核糖所占的比例最少。五种碳源发酵杨树桑黄产EPS两个组分所含单糖组分的种类和含量有显著的差别，尤其是鼠李糖和核糖的含量。同一碳源发酵多糖两种组分的单糖组分含量均不相同，说明碳源对液体发酵产EPS的单糖组分有一定的影响。

（4）EPS的分子质量及分子构象 尺寸排阻色谱（SEC）、多角度激光光散射检测器（MALLS）及示差折光检测器（RI）连用可测定精制EPS绝对分子质量的大小及分子构象。

使用50mmol/L NaNO₃和0.02% NaN₃溶解精制EPS样品，配制成2mg/mL的样品溶液，用0.22μm的水相膜过滤后备用。流速为0.5mL/min，进样量为100μL，样品的dn/dc值根据相关文献设置为0.14mL/g。

使用软件Astra 4.72（美国怀亚特技术公司）计算样品的分子质量大小和均方根的回转半径。均方根的半径是由外推法得到的一阶德拜曲线的斜率决定的。从均方根半径与样品分子质量的双对数曲线中，可以判断多糖分子在水溶液中的构象，具体条件由下列公式给出：

球形：

无规则卷曲：

刚性杆状：

式中，r_i是样品的均方根半径，M_i是样品的分子质量，k均方根半径在Y轴的截距，1/3、1/2和1分别代表样品不同构象的临界坡度值。

①精制EPS黏度的测定：EPS的黏度用乌氏黏度计在（25±0.1）℃的水浴中进行测定。选择溶剂流出毛细管时间大于120s的黏度计，由此可忽略动能校正。用逐步稀释法按以下的Huggins方程和Kraemer方程，将浓度外推至零计算［η］：

其中k′和β为多糖在某温度下某溶剂中的常数，η_sp/c为比浓黏度，lnη_r/c为比浓对数黏度。

②精制EPS均方根旋转半径（Rg）和流体力学半径（Rh）的测定：分子质量中心到各质点（基团）距离平方的平均值的平方根被定义为均方根旋转半径（Rg），它反映单个高分子分子链在空间的伸展程度。流体力学半径（Rh）反映流体力学作用时大分子在溶液中的尺寸，它是一个与高聚物链有相同平移扩散系数的等效球体的半径。Rg通过SEC－MALLS法测得，而Rh通过黏度法获得，根据Einstein理论公式推算：

式中 N_A——阿伏伽德罗常数（6.022×10²³）；

M_w——重均分子质量；

［η］——特性黏度。

均方旋转半径和流体力学半径的比值可以用ρ表示：

③不同碳源发酵两种真菌产EPS的SEC/MALLS分析：利用尺寸排阻色谱（SEC）、多角度激光光散射检测器（MALLS）及示差折光检测器（RI）连用技术，可检测不同碳源发酵杨树桑黄产EPS精制组分的分子质量及其在水溶液中的分布情况，结果详如表3.5所示。

如表3.5所示，以葡萄糖为碳源发酵杨树桑黄得精制EPS两个组分的重均分子质量分别为7.285×10⁵和6.255×10⁵，M_w/M_n即多分散系数分别为7.929和7.950，表明两个组分的分散性均很低，即在水溶液中很容易形成大量的聚集体，溶解度很小。以葡萄糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS精制Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ的均方根半径分别为28.4nm和34.4nm。Fr－Ⅰ和Fr－Ⅱ的均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率分别为0.11和0.16（图3.14），说明其在水溶液中以标准的球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚合体。通过SEC/MALLS测得不同碳源发酵杨树桑黄产EPS各精制组分的分子质量均大于第三章中凝胶过滤法测得的分子质量，这可能是因为精制多糖经过透析后发生了聚集，溶解度降低所致。以蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖为碳源发酵得EPS的多分散性也很低，溶解度很小，其均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率均小于0.3，可知其在水溶液中均以标准的球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚合体。出现这种现象的原因，可能是在进行透析时多糖分子发生聚集所致。不同碳源发酵杨树桑黄产EPS精制组分Fr－Ⅰ（左）和Fr－Ⅱ（右）的均方根半径对分子质量的双对数曲线如图3.14至图3.18所示：

不同碳源发酵杨树桑黄产EPS分子构象的参数如表3.6所示，其中M_w和R_g值通过SEC－MALLS法测得，而R_h通过黏度法获得，根据Einstein理论公式推算得。黏度由乌氏黏度计测定，它反映了在稀溶液中多糖所占的水力体积。通常认为，黏度越小，多糖往往具有比较致密的构象。如表3.10所示，不同碳源发酵杨树桑黄产EPS的黏度有一定差异，其中以乳糖为碳源时发酵所得EPS黏度最小，其分子构象最为紧密。而且分子质量相对较大的EPS精制组分测得的黏度值相对较小，这可能是因为EPS发生了聚集，在水溶液中的溶解度不高，其构象呈高支化的多糖聚合体，该结果与SEC－MALLS中均方根半径对分子质量的双对数曲线斜率的分析结果一致。

k′值在0.3～0.5之间时，表明该溶液对聚合物是良溶剂。如表3.6所示，不同碳源发酵杨树桑黄产EPS各精制组分的k′均大于0.5，说明其在水溶液中的溶解性不高。R_g和R_h的比值为ρ，ρ值可以用来描述多糖分子在水溶液中的链构象，ρ～0.8时，为均一紧密的球形构象；ρ～1.0时，为一个松散连接的超支化链或聚合物；ρ～1.5时，为无规则卷曲的链团；ρ～1.5时，为扩展的刚性链。分析结果可知，以乳糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS的ρ值接近0.8，说明其可能为均一紧密的球形构象；以葡萄糖、蔗糖、果糖和麦芽糖发酵得EPS各精制组分的ρ值均接近于1，说明EPS各精制组分在水溶液中可能为高度分支的多糖聚集体。

（5）小结 红外分析结果可知以葡萄糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ为β－吡喃型的酸性杂多糖，以果糖和麦芽糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为α－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以蔗糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为α－、β－两种构型共存的甘露吡喃型酸性杂多糖；以麦芽糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ为β－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ为α－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以乳糖为碳源发酵获得的EPS为酸性甘露聚糖。五种碳源发酵得EPS精制组分都含有大量葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS可能为酸性多糖；其单糖组分中含量最多的是甘露糖，其次是葡萄糖，鼠李糖和核糖所占的比例最少。通过SEC/MALLS测得不同碳源发酵杨树桑黄产EPS各精制组分的分子质量均大于第三章中凝胶过滤法测得的分子质量，其EPS的多分散性也很低，溶解度很小，而且均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率均小于0.3，可知其在水溶液中均以标准的球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚合体。通过黏度的测定分析k′和ρ值，可知其EPS精制组分在水溶液中的溶解性较低，为高度紧密且具有分支结构的多糖聚合体的构象。

3.1.3 胞外多糖的抗氧化活性研究

真菌多糖具有多种生理活性，如调节机体免疫力、降低血糖血脂、抗辐射、抗衰老、保肝护肝、抗氧化、抗肿瘤等作用，其中抗氧化是最重要的生物活性，是目前国内外研究的热点。传统的抗氧化剂如BHA、BHT等，因其潜在的不安全性，已经被一些国家限制使用。真菌多糖因其来源广泛，生产周期短，安全无毒副作用，提取率高，抗氧化活性强等优势，已经越来越受重视。本课题采用体外实验的方法来研究不同碳源发酵两种真菌产EPS的抗氧化活性，进行体外抗氧化性评价的是羟基自由基和DP P H自由基。

自由基是生物体内具有一定生理功能，如免疫和传导信号过程，含有一个未配对电子的原子或分子，化学性质活泼。而过多的自由基可导致人体正常组织细胞的受损，进而引起辐射损伤、肿瘤、衰老、老年痴呆等各种急性和慢性疾病。

羟基自由基是生物体内最活泼的自由基，它能与大部分的生物大分子反应，从而造成糖类、核酸、脂类、氨基酸等物质的损伤。因此研究真菌EPS对羟基自由基的清除率具有十分重要的意义。本工作采用邻二氮菲—Fe²⁺氧化法对羟基自由基清除率进行测定，其反应式为Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+OH—+·OH。原理为邻二氮菲—Fe²⁺是常用的氧化—还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态改变；邻二氮菲—Fe²⁺水溶液可被自由基氧化为邻二氮菲—Fe³⁺，从而使邻二氮菲—Fe²⁺在510nm处的最大吸收峰消失或降低。

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）是一种以氮为中心，合成的稳定自由基，已广泛应用于各种化合物抗氧化活性的评价。当有自由基清除剂存在时，DP P H自由基接受一个电子或氢原子，形成稳定的化合物，使其醇溶液由紫色消退为黄色，褪色程度与抗氧化活性成定量关系，因此可用分光光度计法快速定量分析各种物质的抗氧化活性。

（1）邻二氮菲法测定EPS对·OH的清除能力 首先配制浓度梯度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的粗EPS溶液10mL。然后取7支洁净的10mL试管，其中5支为实验组，1支作为对照组，1支为调零组。向实验组中分别加入1mL pH为7.4的磷酸缓冲液（0.02mmol/L，PBS），1mL 7.5mmol/L的邻二氮菲溶液，1mL 3.25mM FeSO₄溶液，1mL 1.5% H₂O₂，以及不同浓度梯度的粗EPS溶液2mL。其中调零组以蒸馏水代替2mL的粗EPS溶液，对照组以蒸馏水代替2mL的粗EPS溶液和1mL 1.5%H₂O₂。涡旋震荡混匀后，置于37℃恒温水浴锅中1h。调零组调零后，用紫外分光光度计于510nm处测定实验组和对照组的吸光度值。每组做3次平行，取其平均值。粗EPS对·OH清除率的计算公式如下：

式中 A_i——实验组的吸光度值；

A_j——对照组的吸光度值。

不同碳源发酵杨黄桑黄产EPS对·OH的清除率结果如图3.19所示，可以明显看出碳源对其抗氧化活性有显著影响。不同碳源发酵得粗EPS对·OH自由基的清除能力大小为蔗糖＞果糖＞乳糖＞葡萄糖＞麦芽糖，以蔗糖为碳源发酵得粗EPS浓度为10mg/mL时，其对· OH自由基的清除能力已经达到38.58%，果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源发酵得粗EPS浓度为10mg/mL时，对·OH自由基的清除能力分别为34.50%、30.18%、26.60%、20.68%。通过前面分析可知，以乳糖和麦芽糖为碳源发酵得EPS的分子质量较大，而它们对·OH自由基的清除能力在浓度低于8mg/mL时表现为最低，说明分子质量大小与EPS的抗氧化能力之间可能存在一定关系，这与张佳佳等人的研究结果一致。其原因可能是多糖分子质量较大时，不利于跨越多重细胞膜阻碍进入生物体内发挥生物学活性，而分子质量小的多糖因其良好的溶解性，更容易结合活性位点发挥其生物活性，但分子质量过小的多糖因无法形成聚合结构而无法产生生物活性。因此，分子质量适中的多糖活性最高。以乳糖为碳源发酵得EPS为甘露聚糖型，在浓度为10mg/mL时，其对·OH自由基的清除能力明显高于以葡萄糖和麦芽糖为碳源发酵得的EPS，说明甘露聚糖可能对抗氧化活性有一定影响。不同碳源发酵得EPS所含甘露糖基含量的大小：蔗糖＞果糖＞乳糖＞麦芽糖＞葡萄糖，该结果与对· OH自由基的清除能力大小基本一致，说明甘露糖基也可能与EPS抗氧化活性有密切联系。

（2）EPS对·DPPH清除能力的测定 首先配制浓度梯度分别为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的粗EPS溶液20mL。取11支洁净试管，其中5支为实验组，5支为对照组，1支为空白组。向实验组分别加入2mL粗EPS溶液、2mL 0.1g/L的DPPH 50%乙醇溶液，涡旋震荡混匀后，于25℃水浴中放1h，以50%乙醇溶液为空白于517nm处测定其吸光度A_i。

向空白组分别加入2mL 0.1g/L的DPPH 50%乙醇溶液、2mL蒸馏水，混匀后于25℃水浴中放置1h，以50%乙醇溶液为空白于517nm处测定其吸光度A₀。

向对照组分别加入2mL粗EPS溶液、2mL 50%乙醇，混匀后于25℃水浴中放置1h，以50%乙醇溶液为空白于517nm处测定其吸光度A_j。对照组是为了去除EPS溶液自身颜色对测定的干扰。粗EPS对·DPPH清除率的计算公式如下：

式中 A_i——实验组的吸光度值；

A_j——对照组的吸光度值；

A₀——空白组的吸光度值。

不同碳源发酵杨树桑黄产EPS对·DPPH自由基清除率的结果如图3.20所示，其对·DPPH自由基的清除能力大于其对·OH自由基的清除能力，清除能力大小为蔗糖＞果糖＞乳糖＞麦芽糖＞葡萄糖，该顺序与对· OH自由基清除率的大小基本一致。其中以蔗糖为碳源发酵得EPS浓度为5mg/mL时，其对·DPPH自由基的清除能力已经高达59.17%，以果糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖为碳源发酵得EPS浓度为5mg/mL时，对· DPPH的清除能力分别为44.38%、34.32%、33.43%、22.78%。在粗EPS浓度高于4mg/mL时，以蔗糖为碳源发酵得EPS对·DPPH的清除率显著增加，这可能跟以蔗糖为碳源发酵得EPS的甘露糖基含量最高有关。以蔗糖为碳源发酵得EPS为α－、β－两种构型共存的甘露吡喃型杂多糖，以果糖为碳源发酵得EPS为α－构型的甘露吡喃型杂多糖，因此在粗EPS浓度高于4mg/mL时，前者对DPPH自由基的清除能力显著大于后者，可能是因为含有β－构型的多糖抗氧化能力更强，研究发现α－构型的多糖一般没有活性，而具有抗氧化活性的多糖大多数都具有β－（1→3）－D－葡聚糖的主链结构，食药用菌中的活性多糖，如香菇多糖、猪苓多糖等，其活性成分是具有分支的β－（1→3）－D－葡聚糖。