3.3 小结

通过单因素实验确定杨树桑黄产EPS的最优环境条件为温度28℃、pH7、摇床转速160r/min，最适生长周期为8d，最佳碳源、氮源和无机盐分别是蔗糖、玉米粉和KH₂PO₄。正交试验优化杨树桑黄的最佳培养基组合：40g/L蔗糖，4g/L玉米粉，4mmol/L KH₂PO₄，获得的最大胞外多糖产量为0.352g/L。马勃状硬皮马勃产EPS的最优环境条件为温度26℃、pH 8、摇床转速160r/min，最适生长周期为10d，最佳碳源、氮源和无机盐分别是果糖、大豆粉、KH₂PO₄和MgSO₄。正交试验优化的产EPS的最佳培养基组合：20.0g/L果糖，5.0g/L大豆粉，2.5mM/L KH₂PO₄，2.5mM/L MgSO₄。在优化培养基下，马勃状硬皮马勃EPS产量为2.627g/L。

在摇床优化培养基中，两种真菌的形态学和黏度结果总结如下：杨树桑黄菌丝球随着培养时间的延长逐渐增大，其平均直径、紧密度均逐渐增加，圆度先增加后急剧减小，粗糙度与圆度呈负相关，表现为先减小后增加的趋势。马勃状硬皮马勃的菌丝体呈分枝状生长，群体呈片层状而不是多数丝状真菌的菌球状；发酵液黏度与培养时间正相关，较高的黏度表现出良好的流变学性质，使EPS具有作为食品添加剂开发利用的潜力；与多数大型真菌类似，其发酵液pH与培养时间呈负相关。

两种真菌产EPS经除蛋白、醇沉后，冷冻干燥得到粗多糖。不同碳源发酵杨树桑黄制得的粗EPS精制组分的收集管数大致相同，以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖分别为碳源时，精制多糖组分的收集管数分别：Fr－Ⅰ13～28管，Fr－Ⅱ29～40管；Fr－Ⅰ12～28管，Fr－Ⅱ29～40管；Fr－Ⅰ12～28管，Fr－Ⅱ 29～35管；Fr－Ⅰ 14～24管，Fr－Ⅱ 25～40管；单一组分25～40管。以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ的分子质量为627.5ku；以麦芽糖为碳源发酵得EPS Fr－Ⅰ的分子质量为1153.5ku。以葡萄糖和蔗糖为碳源发酵得EPS Fr－Ⅱ的分子质量为55.0ku；以果糖和麦芽糖为碳源发酵得EPS Fr－Ⅱ的分子质量分别为74.5ku和137.0ku。以乳糖为碳源发酵制得的EPS相对分子质量为101.0ku。

不同碳源发酵马勃状硬皮马勃制得的粗EPS精制组分的收集管数也大致相同，以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖分别为碳源时，精制多糖组分的收集管数：Fr－Ⅰ 13～35管，Fr－Ⅱ 36～45管；Fr－Ⅰ 14～35管，Fr－Ⅱ36～45管；Fr－Ⅰ13～35管，Fr－Ⅱ36～45管；Fr－Ⅰ13～31管，Fr－Ⅱ32～50管；Fr－Ⅰ13～31管，Fr－Ⅱ32～50管。实验测得以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ的分子质量为627.5ku；以麦芽糖和乳糖为碳源发酵得EPS Fr－Ⅰ的分子质量为1563.9ku。以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和乳糖为碳源发酵得EPS Fr－Ⅱ的相对分子质量为4.82ku。

红外分析结果可知以葡萄糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS Fr－Ⅰ为β－吡喃型的酸性杂多糖，以果糖和麦芽糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为α－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以蔗糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅰ为α－、β－两种构型共存的甘露吡喃型酸性杂多糖；以麦芽糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ为β－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以葡萄糖、蔗糖和果糖为碳源发酵获得的EPS Fr－Ⅱ为α－甘露吡喃型的酸性杂多糖，以乳糖为碳源发酵获得的EPS为酸性甘露聚糖。五种碳源发酵得EPS精制组分都含有大量葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS可能为酸性多糖；其单糖组分中含量最多的是甘露糖，其次是葡萄糖，鼠李糖和核糖所占的比例最少。通过SEC/MALLS测得不同碳源发酵杨树桑黄产EPS各精制组分的分子质量均大于第三章中凝胶过滤法测得的分子质量，其EPS的多分散性也很低，溶解度很小，而且均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率均小于0.3，可知其在水溶液中均以标准的球形构象存在，是一种高度紧密而且具有分支结构的多糖聚合体。通过黏度的测定分析k′和ρ值，可知其EPS精制组分在水溶液中的溶解性较低，为高度紧密且具有分支结构的多糖聚合体的构象。

五种碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅰ均为α－吡喃型酸性杂多糖，并含有甘露糖的特征吸收峰。以葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ为α－甘露吡喃型酸性杂多糖，而以蔗糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS Fr－Ⅱ为β－甘露吡喃型酸性杂多糖。EPS精制组分的单糖组分主要包括阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸，其种类和含量有显著的差别，尤其是鼠李糖和阿拉伯糖的含量。EPS各精制组分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，说明发酵所得的EPS可能为酸性多糖。

SEC/MALLS测得其EPS各精制组分的分子质量均大于第三章中凝胶过滤法测得的分子质量，多分散性也很低，溶解度很小，均方根半径对分子质量的双对数曲线的斜率均小于0.3，可知其在水溶液中均以球形构象存在，是一种高度紧密且具有分支结构的多糖聚合体。通过黏度的测定分析k′和ρ值，可知其EPS精制组分在水溶液中的溶解性也较低，为高度紧密且具有分支结构的多糖聚合体的构象。

不同碳源发酵杨树桑黄和马勃状硬皮马勃产EPS对·OH和·DPPH的清除率有明显差异，其抗氧化活性表现出的差异与其结构的差异性有明显的关联。以蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源发酵杨树桑黄产粗EPS浓度为10mg/mL时，对· OH自由基的清除能力达到最大，分别为38.58%、34.50%、30.18%、26.60%、20.68%；以蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖为碳源发酵杨树桑黄产EPS浓度为5mg/mL时，对·DPPH自由基的清除能力达到最大，分别为59.17%、44.38%、34.32%、33.43%、22.78%。以果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS浓度为10mg/mL时，对· OH的清除率达到最大，分别为22.65%、18.87%、16.69%、14.86%、13.66%；以果糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖为碳源发酵马勃状硬皮马勃产EPS浓度为5mg/mL时，对·DPPH的清除能力达到最大，分别为41.32%、33.53%、31.10%、25.77%、20.23%。经分析可知，分子质量适中的多糖活性最高；具有较高黏度多糖的抗氧化活性较低；甘露聚糖可能对抗氧化活性有一定影响；β－构型的多糖抗氧化能力更强；单糖组分的种类和含量，尤其是甘露糖基，对抗氧化活性也有重要影响。

本工作研究了两种真菌液体深层发酵培养条件的优化及形态学，并在该优化条件的基础上进行发酵罐培养，利用不同碳源发酵制备EPS，经分离纯化后，利用红外光谱仪、GC/MS、SEC/MALLS、乌氏黏度计对其分子结构进行表征分析，最后通过EPS对·OH和·DPPH清除率的测定，分析其结构与生物活性之间的关系。该论文的研究为两种真菌在医药及食品行业的应用提供了理论基础，也为进一步阐述多糖的构效关系提供参考。

多糖的构效关系一般是指多糖的一级结构、高级结构及其理化性质与其生物活性之间的关系。对多糖结构进行分析，需要研究其单糖组成和含量、糖苷键的类型、主链构型、官能团、空间构象等，多糖的理化性质包括分子质量、溶解度、黏度等。本工作主要研究了碳源对两种真菌多糖的一级结构及在水溶液中的构象，还有其分子质量、溶解度、黏度等理化性质的影响，阐述了其结构、理化性质与生物活性之间的关系。但由于实验提取得到的真菌多糖为结构复杂的杂多糖，纯度较低，生物活性不稳定，因此很难在分子水平上阐明其构效关系及其作用机制。而且对影响多糖活性的各种因素，不能单方面的进行考虑分析，还要分析其结构与结构之间、结构与理化性质之间的相互关系对多糖生物活性的影响。我国对多糖结构的研究起步较晚，其构效关系仍然是一个技术难点，需要进一步深入研究。