2.3 小结
本课题以二年残孔菌和虎皮香菇为研究对象，以两种真菌所产胞外多糖含量为指标，确定培养基的优化方案，优化发酵罐产胞外多糖的条件及对发酵过程动力学、形态学和流变学的分析，此外，通过添加表面活性剂和有机溶剂提高两种真菌产胞外多糖的产量，然后对吐温80和丙酮对多糖分子表征、抗氧化能力及抗肿瘤活性进行系统的研究，确立了系统可行的实验方法。
2.3.1 发酵条件的优化
单因素实验得出，二年残孔菌的摇瓶最佳培养条件：培养时间8d，碳源为4%麦芽糖，氮源蛋白胨，C/N比5，无机盐KH2PO4，pH5；虎皮香菇的摇瓶最佳培养条件：培养时间12d，碳源为6%乳糖，氮源酵母粉，C/N比15，pH 8。在此基础上，选用C/N比、通气率和搅拌速度三个因素，运用旋转单一法对二年残孔菌的发酵罐条件进行优化，当C/N比为18.33，通气率为0.67vvm，搅拌速度定为50r/min时，胞外多糖的产量比未优化前提高3倍，最大胞外多糖产量可达13.09g/L；同样选用C/N比、通气率和搅拌速度三个因素，运用均匀设计法对虎皮香菇的发酵罐条件进行优化，优化可知：C/N比为25，搅拌速度为202r/min，通气率为1.5vvm，经验证实验可知，在优化条件下培养，胞外多糖含量为56.58g/L。在液体发酵培养中，发酵条件对真菌菌丝的生长与代谢产物的生成与积累有关键的影响，因此发酵条件的优化为后续实验和工业化生产奠定一定的基础。
2.3.2 深层发酵的形态学与流变学研究
利用显微镜、黏度计等实验室常用的试验仪器对两种真菌的形态学与流变学进行研究。形态学主要研究真菌的菌丝体形态，计算两种真菌在不同时期菌丝的平均直径、粗糙度、紧密度、圆度。流变学主要研究两种真菌发酵产胞外多糖与其黏度的关系。二年残孔菌在优化和未优化的发酵条件下，菌丝干重和EPS产量均呈正相关（P＜0.05）；菌丝球的平均直径在优化培养基中与菌丝干重呈正相关（P＜0.01），与EPS产量呈正相关（P＜0.05）；菌丝球的圆度在优化培养基中与菌丝干重和EPS产量均呈负相关性，并无显著差异；优化发酵条件下的发酵液黏度与EPS产量有极显著的相关性（P＜0.01）。发酵罐扩大培养后，虎皮香菇优化后的发酵条件在形态学、流变学参数均优于未优化发酵条件，菌丝球的圆度与优化条件中的菌丝干重呈正相关（P＜0.01），与EPS产量呈显著正相关（P＜0.05）；紧密度与优化发酵条件下EPS产量在0.01水平呈正相关；粗糙度与优化和未优化发酵条件中的菌丝干重和EPS产量呈负相关。流变学方面，发酵液黏度与菌丝干重和EPS产量在优化发酵条件中均呈极显著相关性（P＜0.01）。由此可见，发酵液黏度及形态学参数与真菌菌丝生物量和代谢产物的积累有很大的关系。
表面活性剂和有机溶剂处理对两种真菌胞外多糖的产量及结构分析：在发酵中后期，分别添加表面活性剂和有机溶剂可增加细胞膜的通透性，提高胞外多糖的产量。实验结果可知，发酵培养中分别添加吐温80和丙酮后，二年残孔菌的胞外多糖产量达7.21g/L和9.54g/L，较对照组相比提高了10.03%和45.60%，虎皮香菇的胞外多糖产量达12.29g/L和20.83g/L，比对照组提高了22.30%和107.26%，这可能是由于吐温80和丙酮处理后，增加了细胞通透性，细胞活力降低，促使细胞内的多糖释放到发酵液中，这也是吐温80和丙酮在发酵中后期的重要原因。
在此基础上，收集添加吐温80和丙酮后两种真菌胞外多糖的粗品，经过Sepharose CL－6B层析柱分离纯化可知，二年残孔菌和虎皮香菇胞外多糖均为单一组分。使用气相色谱/质谱（GC/MS）、傅里叶红外光谱仪、热重分析技术及刚果红实验对二年残孔菌和虎皮香菇EPS分子进行初步表征。丙酮、吐温80处理后的二年残孔菌胞外多糖和对照组的胞外多糖中，其单糖种类和含量均发生了变化，单糖含量最高的均为甘露糖和葡萄糖，但丙酮处理后的EPS仅含有7种单糖，缺少D－（+）－半乳糖；对照组和丙酮、吐温80处理的二年残孔菌EPS均含有α－型和β－型的吡喃多糖，是非均一组分构成的多糖。发酵中后期，培养基中添加吐温80和丙酮后，虎皮香菇胞外多糖的结构也发生了变化，吐温80和丙酮处理的虎皮香菇胞外多糖均为β－D型酸性杂多糖。
刚果红实验表明，吐温80和丙酮处理的二年残孔菌EPS具有三股螺旋结构，虎皮香菇经吐温80和丙酮处理后构象发生了变化，其胞外多糖出现了明显的三股螺旋结构；这对于真菌多糖的抗肿瘤活性有直接的关系。热重分析结果表明二年残孔菌经吐温80和丙酮处理后均发生了热裂解；吐温80处理后的虎皮香菇EPS热稳定性比经丙酮处理后好。凝胶渗透层析法测定二年残孔菌胞外多糖的分子质量可知：对照组二年残孔菌EPS分子质量为22.1ku，吐温80处理的二年残孔菌EPS分子质量为40.5ku，丙酮处理的EPS分子质量为55.0ku；对照组虎皮香菇EPS分子质量为12.0ku，吐温80处理的EPS分子质量为22.1ku，丙酮处理的EPS分子质量为137.0ku。多糖的化学结构、分子链构象和分子质量极大地影响其生物活性，有报道称多糖分子质量在10.0～150.0ku范围内生物活性更强，当三股螺旋结构变成单股链后活性降低。
2.3.3 表面活性剂和有机溶剂处理对两种真菌胞外多糖生物活性的研究
采用常见的水杨酸法、DP P H法和MTT法对不同处理下两种真菌胞外多糖的抗氧化能力及抗癌能力进行测定。就二年残孔菌而言，添加吐温80和丙酮后，均提高了其胞外多糖对羟基自由基和DP P H自由基的清除能力，且清除效果与胞外多糖的浓度关系在一定的浓度范围内呈正相关。胞外多糖浓度为10g/L时，丙酮处理的二年残孔菌EPS，对羟基自由基和DPPH自由基清除力达到63.23%和44.26%，较对照组的二年残孔菌EPS显著提高。当多糖浓度为10g/L时丙酮处理的虎皮香菇EPS羟基自由基清除率为29.26%；当多糖浓度为8g/L时，丙酮处理的虎皮香菇EPS DPPH自由基的清除率达到63.08%，比对照组提高近2倍。据报道，多糖立体结构中的β－螺旋结构具有强的生物活性，这可能是吐温80和丙酮处理后，改变了两种真菌多糖的立体结构，从而提高了生物活性。
在抗肿瘤能力方面，主要研究对Hepg 2细胞和MG63细胞的抑制作用，结果表明，Hepg 2细胞培养72h，多糖浓度达到400μg/mL时，吐温80处理的二年残孔菌EPS对Hepg 2细胞的抑制率与对照组相比呈极显著关系（P＜0.01），最大抑制率达33.45%，比对照提高156%；MG63细胞培养72h，多糖浓度达到400μg/mL时，丙酮处理的二年残孔菌EPS对MG63细胞的抑制率与对照相比呈显著关系（P＜0.05），最大抑制率为20.95%，比对照提高72.85%。丙酮和吐温80处理后，虎皮香菇的EPS抗肿瘤活性也有了显著提高，丙酮处理的EPS浓度达到400μg/mL时，与对照相比显著（P＜0.01），对Hepg 2细胞的抑制率达到22.85%，比对照组提高134%，丙酮处理EPS对MG63细胞的抑制率达到25.29%，与对照组提高135%。这与吕俊等研究者的文献报道一致，吕俊研究表明，银耳多糖的主链结构为甘露聚糖，支链由木糖和葡萄糖醛酸组成，其可诱导肝癌Hepg 2细胞凋亡，从而抑制细胞的增殖。
2.3.4 展望
如今，在市场上已有许多食用菌产品出现，真菌多糖为主的功能性成分的保健食品也随之出现，且已有多种真菌多糖开发成药剂。然而，对多糖的结构以及生物活性的研究起步较晚，自然界中仍然存在大量未开发的真菌资源。为促进真菌多糖在发酵产业、食品工业、医疗保健等领域的应用，其构效关系、免疫作用机制及其作用于哪些靶细胞和受体等方面都仍然需要做进一步研究。此外，对真菌多糖的抗肿瘤作用、抗衰老活性以及其构效关系和量效关系的作用机理进行深入探讨，可以促进其在临床中的应用。对真菌多糖做出更加深入的研究，将会对人类健康事业的做出一大贡献。
真菌多糖构效关系主要包括高级结构对活性的影响、溶解度对活性的影响、结构改造和修饰对活性的影响、分子质量对活性的影响，及真菌多糖的药理作用机制，特别是在分子水平上的作用机理均有待于深入研究，这些研究可很大程度地促进真菌多糖的开发、生产，开拓其应用领域。