微生物细胞含水量一般为80%～90%，菌细胞对光的吸收和反射与水溶液相近，在光学显微镜下，菌体透明，与背景几无反差，故常借助于染色使菌体吸着染料产生与背景较明显的差别，从而识别其个体形态和部分结构。但染色后的菌体是死细胞，其形态与结构会发生一些变化。同时，受到光学显微镜分辨能力的限制，欲观察其细微结构，尚须使用电镜。

微生物细胞染色的基本原理是根据细胞对染料的毛细现象、渗透、吸附、吸收等作用和细胞物质和染料的不同性质而发生的化学反应。细胞的酸、碱性对染料的吸附程度不同，如细胞核含大量核酸物质为酸性，对碱性染料有亲和力，易于着色，必要时应改变其反应条件（如pH）。细菌的等电点一般为pH2～5，在中性、碱性或弱酸性溶液中（pH大于其等电点Ⅰ），均带负电荷，而碱性染料离子带正电荷，因此带阴电的细菌易与带阳电的染料结合，所以细菌一般常用碱性染料染色。若细菌在其等电点低的pH溶液中，则带正电荷，则易于与带负电荷的染料染色。

影响微生物细胞染色除与菌细胞结构及其外膜的通透性、膜孔的大小及细胞结构的完整有关外，还与培养基的组成、细胞的菌龄、染色液中的电解质量、pH、温度、药物的作用等有关。

微生物学使用的染料都是含有苯环的有机化合物，含有色基（chromophore group）与助色基（auxochrome group）。一种染料不仅含有色基，还必须具有使该化合物以电离特性的助色基。助色基不是产生色泽的原因，其作用仅是使该化合物能构成盐的性质，助色基本身能够解离，解离后的染料可与被染物结合，着色。助色基的性质，决定染料是酸性或是碱性。碱性染料常用氯化物、硫酸盐、醋酸盐、草酸盐等，电离后染料带阳电；酸性染料通常为钠盐、钾盐或铵盐，电离后染料带阴电。常用的碱性染料有亚甲蓝（美蓝）、甲紫、碱性复红、中性红、沙黄、孔雀绿等；常用的酸性染料有酸性复红、曙红、刚果红、苦味酸等。

碱性染料与酸性染料的结合物称中性染料，也称复合染料，如瑞氏染料、姬姆萨染料，常用于组织细胞染色。

还有一些染料如苏丹类染料，化学亲和力低，不溶于水，可溶于脂溶剂中，适用于脂肪染色。

微生物实验常用染料见表3-1。

为单染色法和复染色法。

用于观察菌体的形态和排列。

亚甲蓝染液或稀释石炭酸复红（碱性品红）液（配法见表3-1）。

1） 涂片：用接种环挑取菌落（或液体培养物）于滴有一滴水的洁清载玻片上，充分涂匀，制成薄涂片。若是液体待检物，直接涂抹即可。

2） 干燥：在室温中自然风干或置37℃培养箱中待干。

3） 固定：除作荚膜和鞭毛染色者外，均可将玻片迅速通过火焰固定，以不烫手为宜，温度过高，影响染色效果。

4） 染色：用亚甲蓝染液（或稀释石炭酸复红染液）1～2滴，覆盖涂抹，1min后倾去染液，以水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，至冲下的水基本无色。

已染好的片子，用吸水纸将水吸干后，先用低倍镜找准目标，于涂抹处滴加香柏油一滴，用油镜检查。

可用于鉴别细菌及观察细菌的某些特殊结构。

革兰染色是一种极有价值的分类染色法，通过染色，可将全部细菌分成两大类——革兰阳性菌和革兰阴性菌。关于染色的机制，与细胞壁的结构与组成密切相关。革兰阳性菌的细胞壁中肽聚糖含量高（30%～60%），脂类含量低（1%～4%），经乙醇或丙酮处理后脱水，可引起肽聚糖层的孔径变小，通透性降低以至甲紫与碘的复合物可保留在菌体内，不被脱去而呈蓝紫色。革兰阴性菌的细胞壁中脂类物质含量较高（11%～22%），肽聚糖含量较低（约10%），用乙醇或丙酮处理时，脂类物质被溶解，使细胞壁的通透性增大，以至结晶紫与碘的复合物脱出细胞外，故可被沙黄复染液着色而显红色。

甲紫染液和番红染液，配法见表3-1。

1） 涂片、干燥和固定同单染色法。

2） 将甲紫染液滴加在已固定的涂片上，染1min，水洗干净。

3） 滴加革兰碘液作用1min，水洗，沥干。

4） 滴加95%乙醇（或乙醇丙酮混合液）脱色，侧动玻片，至无紫色脱落为止（约20～30s），水洗。

5） 滴加番红染液复染30s～1min。水洗，待干。油镜检查。

革兰阳性菌G ⁺，菌体呈蓝紫色；革兰阴性菌G ^-，菌体呈红色。

革兰染色操作并不复杂，但欲准确染色，使之成为判断一株未知革兰阳性菌或阴性菌的依据，并非易事，必须严格掌握以下几点：

1） 在涂片、染色时，应使用夹子夹持载玻片，切勿用手直接拿载玻片，用过的载玻片和盖玻片应置消毒液中消毒后，再洗刷清洁。

2） 待检菌菌龄应为18～24h，一般情况下，革兰阴性菌的染色反应较稳定，不易受菌龄长短影响；而革兰阳性菌，有的在幼龄时呈阳性，超过24h可变为阴性。故培养物越陈旧，菌细胞衰老、死亡，则染色常为阴性，造成错判。

3） 涂片以匀薄为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因洗脱不匀常呈假阳性。革兰染色时，要以分散开的细菌着色为准。涂片后自然干燥；若经火焰固定时，应以温热不烫手为度，以免菌体受损，致使染色反应不准。

4） 革兰染色操作的关键步骤是对脱色的掌握，脱色时间不足，革兰阴性菌可染成阳性菌；脱色过度，革兰阳性菌会染成阴性菌。

5） 碘液配制后，应装在密闭的暗色瓶内储存。如因储存不当，部分碘将被挥发或被还原，试液由原来的红棕色变为淡黄色，以致影响固定甲紫的作用，故不宜再用。

细菌芽孢含水量低，孢壁厚而致密，折光性强，能阻止一般染料渗入，因而一般染色芽孢不着色，仅是芽孢壁与菌体着色，芽孢不受色，为一空圈。采用芽孢染色法，以碱性品红或孔雀绿加热，使芽孢着色，再经复染菌体，菌体与芽孢颜色明显区别。以下两法效果均好。

1） 染液：碱性品红（石炭酸复红）及亚甲蓝染液（配法见表3-1）。

2） 方法：以待检菌24～48h培养物，按常法制片、固定。滴加碱性品红染液数滴于涂片上，用夹子夹住载玻片，在乙醇灯火焰上方微微加热，使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加此染液，保持温度并勿使涂层干涸，约5min，待冷后倾去染液，用水冲洗。以95%乙醇脱色30s，水洗。再加亚甲蓝染液染色30s，水洗、待干。镜检。芽孢为红色，菌体为蓝色。

1） 染液：5%孔雀绿水溶液及0.5%番红液（配法参见表3-1）。

2） 方法：于涂抹处滴加5%孔雀绿染液，微火加热，使冒蒸汽，但不应干涸（随时补加染液）保持5min水洗。再以番红液复染1min。水洗、吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体或芽孢壁呈微红色。

鞭毛染色难度较大，染色片制备须注意以下几点：

1） 菌种：要求用新鲜的幼龄菌种，培养16～18h。

2） 载玻片：所用的载玻片，应十分清洁，无油污，用重铬酸清洁液处理后，置于95%乙醇中脱水备用。临用时取出，用火焰烧去乙醇，立刻涂片。

3） 涂片：先在载玻片的一端沾1～2环水，再用接种环蘸取斜面下端湿润处的菌苔少许，于载玻片的水滴中轻沾数次，然后将载玻片稍稍倾斜，使菌液缓慢移动，慢慢散开至另一端。再平放在空气中自然干燥，或置于37℃培养箱内待干。制片时严禁涂抹，不得经火焰干燥固定。

硝酸银鞭毛染色法与碱性复红鞭毛染色法。

1） 硝酸银鞭毛染色法：此法适用于多数菌株的鞭毛染色。

染液：分甲液和乙液。

甲液：先将丹宁酸（鞣酸）5.0g置于水100ml中，加热溶解。冷却后，加入三氯化铁（FeCl ₃）1.5g、15%甲醛2ml、1%氢氧化钠1ml，溶解混匀即成。

乙液：硝酸银（AgNO ₃）2.0g，溶解于水100ml中。先取出20～30ml放在烧杯内，徐徐滴加浓氢氧化铵（NH ₄OH），开始时形成浓厚的沉淀，可继续滴加氢氧化铵至沉淀成为澄清溶液为止。再将余下的硝酸银溶液慢慢滴入，如果出现薄雾状沉淀，轻轻摇动即又消失时，可继续滴入硝酸银溶液，直到摇动后仍可呈现极轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。此时溶液通过光线观察应清晰，在暗色背景下略为淡雾状。如银盐析出的沉淀较多，不宜使用，须用剩余的硝酸银溶液，重新配制。

甲液中的甲醛和氢氧化钠起固定作用，丹宁酸和三氯化铁作媒染剂。乙液为银染液。这两种染液均不易保存，配制后当日使用，次日效果差，第三日失效。

方法：滴甲液于涂片上，染3～5min，用水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，再滴加乙液染30～60s，并于乙醇灯火焰上稍微加热，使略微冒蒸汽，但勿使染液干涸，最后用水冲洗。待自然干燥，勿用滤纸吸干，以免碰损鞭毛。镜检时应多观察几个视野，多数只在部分部位上染出鞭毛。

结果：鞭毛呈褐色，菌体为深褐色。

注意事项：应充分洗净甲液后，才能复染乙液，否则背景很脏。

染色时间应掌握好；时间不足，会使鞭毛着色过浅；染色过度，又能使鞭毛上面聚集过多的染料成团块状，不易辨认。

2） 碱性复红鞭毛染色法

染液：分甲液和乙液。

甲液：碱性复红明矾鞣酸混合液

取5%钾明矾水溶液10ml，与20%鞣酸水溶液10ml，分别加热溶解至透明，然后混合。再加入1%碱性复红乙醇（95%）溶液10ml，边加入边摇动，混合均匀。放置片刻，取上清液备用。此液不稳定，约可储用1周。

乙液：取亚甲蓝0.1g和硼砂0.5g（或1.0g，同时溶解于水100ml中）。

方法：将涂片放在空平皿或瓷盘内，滴甲液盖满标本，置37℃培养箱内，染色约15min。取出后，用水轻轻冲洗并沥去残水。再用乙液复染10min。最后用水冲去染液，自然干燥后镜检。

结果：鞭毛呈红色，菌体为蓝色，鞭毛和菌体的颜色清晰易见。

在实际工作中，一般霉菌、放线菌及酵母菌观察，无需染色，直接进行不染色的活体检查或用单染色法为多，在革兰染色中，霉菌、放线菌和酵母菌皆为革兰阳性，对区别种属意义不大。以下介绍几种常用方法。

结晶酚20g、乳酸20ml、甘油40ml、水20ml混合上述成分、徐徐加热溶解、再加入棉蓝0.05g，混匀溶解，必要时过滤。

在载玻片上滴加染液，然后挑取霉菌菌丝少许，在染液中轻轻拨散，盖上盖玻片。必要时在乙醇灯上微微加温，以排除气泡。显微镜观察，菌丝体呈蓝色。

亚甲蓝染液或甲紫染液。

用接种铲将长有菌落的培养基一并挑出，置载玻片中央，用另一块载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片、干燥、固定。滴加亚甲蓝染液或甲紫染液，染30～60s水洗后干燥以油镜观察。菌丝体呈蓝或紫色。

或取清洁盖玻片一块，在菌落上轻轻一按，然后将印有痕迹的一面朝下、放在有一滴甲紫染液的载玻片上，即可在盖片上滴加香柏油用油镜检查。可观察到着色的孢子。

酵母菌是单细胞真菌，其形态易于识别。活酵母细胞可耐受0.1%亚甲蓝染色液而不被着色，而死的酵母菌则被染成蓝色。若以酵母菌待检物涂片，以亚甲蓝染色或革兰染色法染色，则为蓝色或紫色的细胞，不易观察其细胞结构。

酵母菌的子囊孢子个体较小，壁较厚、原生质较浓，一般染色不易着色，可用芽孢染色法染色，其方法如下：

石炭酸沙黄液（沙黄0.1g溶于10ml 95%乙醇中，然后加入30%石炭酸90ml），酸性乙醇（盐酸3ml，加95%乙醇97ml中），1%亚甲蓝液。

取待检物的48h麦芽汁培养物，离心，洗涤得菌体。将菌体大量涂布在琼脂斜面上，于25～28℃培养3天以上，可产生子囊孢子。将此培养物涂片、火焰固定。将石炭酸沙黄液滴加一层，并在火焰上方加热，要求冒气但不沸腾。为了防止干涸，不时滴加染液。加热约5min，水洗，加酸性乙醇脱色约30min，水洗，加亚甲蓝液复染1min，镜检。子囊孢子为红色，菌体为蓝色，可以观察到子囊孢子的形状、特点及每个子囊内的孢子数。

也可用孔雀绿-沙黄染色法染色，其方法如细菌芽孢染色。染色结果子囊孢子呈绿色，菌体呈红色。