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第五节 血 友 病
血友病是一组遗传性出血性疾病,其中包括血友病A、血友病B、FⅪ缺乏症(以往称为血友病丙)。本组疾病是一组遗传性凝血活酶生成障碍所致的出血性疾病,在先天性出血性疾病中最为常见。实验室检查出血时间、血小板计数、PT均正常,但APTT延长。APTT纠正试验可鉴别遗传性凝血因子缺乏和抗凝物质存在所致的APTT延长。凝血因子活性检测可明确因子缺乏的程度以帮助血友病严重程度分型。vWF: Ag和vWF: CBA检测可对血友病和血管性血友病进行鉴别。
一、 实验室分析路径
实验室分析路径见图3-5。
二、 相关实验
血友病的实验室诊断及鉴别诊断主要包括筛选试验、确诊试验和鉴别诊断试验。
1. 血浆凝血酶原时间(PT )测定。
2. 血浆活化部分凝血活酶时间(APTT )测定。
3. 出血器测定出血时间(TBT)。
4. 血小板(PLT )数量检测。
5. APTT纠正试验。
6. 凝血因子活性检测。
图3-5 血友病的实验室分析路径图
7. 血友病的基因诊断
利用分子生物学技术可对血友病进行直接基因诊断和间接基因诊断。直接诊断是找到导致疾病的基因缺陷;间接诊断是利用检测相应基因内、外特定位点的多态性,结合遗传连锁分析,确定受检个体是否带有含致病基因的染色体。通过基因诊断,可对患者家系成员中的相关女性及胎儿进行携带者和产前诊断的遗传咨询。
8. vWF抗原(von Willebrand factor antigen, vWF: Ag )检测
是对vWF数量的检测。vWF: Ag可用免疫电泳(Laurell火箭电泳)、酶联免疫吸附试验(ELISA )、免疫放射测定法(IRMA )及免疫浊度法进行测定。免疫浊度法检测的原理是用抗vWF的单克隆抗体包被乳胶微粒,其与待检血浆中的vWF特异地结合,发生凝集,从而使得反应体系中的浊度增加,吸光度增加,通过测定吸光度的变化可反映受检血浆中vWF的含量。结果用正常对照的百分比表示,正常参考范围为50%～160%。血浆vWF水平在运动、妊娠、月经时可能增高,这些情况可能掩盖中度的vWF水平降低。血浆中存在有类风湿因子、抗牛血清白蛋白抗体或抗鼠抗体时,可能使vWF: Ag水平假性增高。
9. vWF胶原结合分析(von Willebrand factor collagen binding assay, vWF: CBA)
vWF: CBA是同时检测vWF的数量和质量,反映vWF与胶原作用的能力。常用ELISA方法检测。其原理为用胶原包板,加入一定量的血浆vWF使其与胶原结合,多余的vWF洗去,再加入酶标记的抗vWF单抗显色测定vWF与胶原结合的能力。结果用正常对照的百分比表示,正常参考范围为50%～400%,影响vWF: Ag的因素也会对vWF: CBA造成相同的影响。
三、 结果判断与分析
（一） 筛选试验
1. PT 和APTT
血友病患者由于缺乏内源性凝血途径中的FⅧ或FⅨ或FⅪ,因而检测通常结果为APTT延长, PT正常。但对于轻型血友病患者,其FⅧ: C轻度降低, APTT可能正常。先天性因子Ⅴ增多症、血栓前状态、DIC高凝期、血浆内混有血小板、口服避孕药时APTT缩短可影响检测结果的判断。
2. 血小板计数
血友病患者在未合并血小板数量异常时血小板通常正常。
3. TBT
血友病患者TBT正常,可与血管性血友病(vWD)患者初步鉴别(vWD时APTT也可能延长,但其TBT也延长)。
（二） 确诊试验
1. APTT纠正试验
该试验可帮助判断延长的APTT是由于内源性凝血因子缺陷或抗凝物质存在所致。当正常血浆与受检血浆1︰1混合后其延长的APTT可以被纠正,提示为内源性凝血因子缺陷,但低滴度的抗凝物质可因1︰1混合血浆的稀释而使延长的APTT被纠正,因此应进一步作正常血浆与受检血浆1︰4的混合纠正试验,若低滴度的抗凝物质存在,则1︰4的混合血浆不能纠正。对于1︰1不能纠正的抗凝物质,建议作混合血浆的孵育试验,孵育后的APTT时间更长,则提示为特异性抗体(抗凝血因子抗体)存在;孵育后的APTT时间不变,则提示受检血浆中有非特异性的抗凝物质(如抗磷脂抗体或副蛋白)存在。当有抗凝物质存在时,临床表现常有出血倾向,但有抗凝磷脂抗体时,临床上表现为无症状或易形成血栓。
2. 凝血因子活性检测
当APTT纠正试验证实系内源性凝血因子缺陷所致APTT延长时,可进一步检测凝血因子活性以明确何种凝血因子缺陷及缺乏的程度。以血友病A (FⅧ缺乏)最常见,通常首先进行FⅧ: C检测; FⅧ: C正常再进行FⅨ: C、FⅪ: C的检测。如FⅧ: C异常,需进一步鉴别血友病A与vWD。
3. 血小板中和试验
纠正试验提示存在狼疮性抗凝物质时,可用血小板中和试验进一步证实。患者血浆中加入冻融的血小板后,延长的APTT时间得以纠正,可证实血浆中存在狼疮抗凝物质。
（三） 鉴别诊断试验
1. vWF: Ag检测
该实验是对vWF抗原量的检测,不能检测vWF活性变化。vWF: Ag水平降低对1型和2型vWD可诊断,但对2型vWD不能进行诊断。
2. 胶原结合分析(vWF: CBA )
该项试验可同时检测vWF的数量和质量,反映vWF与胶原作用的能力。对于三种类型vWD的诊断,均能提供很好的信息。
（四） 分子生物学检测
1. 血友病A的基因诊断
先测FⅧ内含子22倒位和内子1倒位,可检出约50%重型患者;再进行遗传联锁分析,检测FⅧ基因内、外8个STR位点,包括DXS15、DXS52、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108、F8civs22、F8civs13及性别基因位点等,基本可得到明确诊断,不能诊断者可直接测序明确诊断。
2. 血友病B的基因诊断
通过遗传联锁分析,检测FⅨ基因外的6个STR位点,包括DXS8094、DXS1211、DXS1192、DXS102、DXS8013、DXS1227及性别基因位点,基本可得到明确诊断,不能诊断者可直接测序明确诊断。
（五） 常见疾病的诊断标准
1. 血友病A诊断标准
临床表现:男性患者,有或无家族史,女性纯合子型可发生,极少见;关节、肌肉、深部组织出血,可自发。实验室检查:试管法凝血时间重型延长,中型可正常,轻型、亚临床型正常; APTT重型明显延长,能被正常新鲜及吸附血浆纠正,轻型稍延长或正常,亚临床型正常;血小板计数、出血时间、血块收缩正常; PT正常; FⅧ活性减少; vWF: Ag正常, FⅧ: C/vWF: Ag明显降低。
2. 血友病B诊断标准
临床表现同血友病A。实验室检查:凝血时间、血小板计数、出血时间、血块收缩及PT同血友病A; APTT延长能被正常血清纠正,但不能被吸附血浆纠正,轻型患者APTT可正常,亚临床型正常; FⅨ活性降低。
3. FⅪ缺乏症诊断标准
临床表现:不完全性常染色体隐性遗传;纯合子有出血倾向,杂合子可无出血症状;出血一般不严重,表现为鼻出血、月经过多,小手术后出血,关节、肌肉出血少见。实验室检查:凝血时间正常或接近正常;血小板计数、出血时间、PT正常; APTT延长能被正常吸附血浆及血清同时纠正; FⅧ、FⅨ活性正常, vWF: Ag正常; FⅪ活性降低。