药物基因组学与临床个体化治疗以每位患者的遗传信息为基础来制订个人的治疗方案，因此其常用的检测技术主要为针对遗传物质的分子检测。由于遗传物质的存在和变异形式多样，因此相关的检测技术也较为复杂。根据需要选择合适的检测方法，检测过程中进行严格的质量控制，对于检测结果进行合理的解读是开展个体化治疗临床检测的基础。一种理想的分子检测方法应该具备以下特征：①操作简单、快速；②低成本；③结果准确；④操作过程自动化程度高，尽量没有人工干预；⑤结果数据分析简单；⑥通量高，且有较大的灵活性，可以用来检测不同类型的分子。一种方法通常很难具备上述所有特征，因此根据需要来挑选不同的检测方法至关重要。本章内容将具体阐述当前用于个体化治疗临床检测的几种主流分子检测技术，包括它们的基本原理，优缺点，主要步骤和临床应用，它们各自的优缺点总结见表2-1。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)技术简称PCR技术，是分子检测领域革命性的技术之一。其于1983年由Kary Mullis发明，发明者也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR技术可以在体外短时间内对DNA分子直接进行大量扩增，由于其具有灵敏度高，操作简单，省时省力，并可以自动化运行等特点，PCR及其衍生技术已被广泛应用到个体化医学分子检测的各个方面，成为很多检测手段的必需步骤之一。PCR技术由以下三个基本步骤构成：①变性：通过加热使模板双链DNA解链成单链DNA；②退火：降低温度使引物与模板单链DNA结合；③延伸：在DNA聚合酶的作用下，按照碱基配对原则，以引物为起点合成一条与模板链互补的新链。以上三个步骤构成一个循环周期，每个周期合成的产物成为下一个周期的模板，经过28～35个循环后，初始DNA分子得到大量扩增（图2-1)。

基于该技术衍生出很多分子检测的技术，下面针对个体化治疗中常用的PCR及其衍生技术进行介绍，并就其中临床最常用的部分技术进行详解。

等位基因特异性PCR又称之为扩增阻滞突变系统PCR（amplification refractorymutation system PCR，ARMS-PCR)。该技术所基于的原理为 Taq DNA聚合酶缺乏3′到5′端的外切酶活性，因此3′端错配的碱基会导致引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3′端配对的碱基，反之则有。因此，AS-PCR反应需要两条等位基因特异的引物和一条公用的反向引物，两条非特异性引物在3′端与模板错配，但其他部分则完全一样。只有引物的3′端与模板完全配对时，PCR扩增才可以进行。然后通过电泳检测PCR产物来进行基因型的鉴定。该方法也可以与实时荧光定量PCR结合来分型。具体原理见图2-2。此法简单易行，灵活度高，成本较低，所需仪器设备简单。由于进行了PCR扩增，因此其最大的优点是可以检测低丰度的突变，但此法通量较低。

该实验方法所需试剂包括检测位点PCR反应液、质控PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs、相应突变位点特异性引物)、酶混合液（含 Taq酶等)、阳性对照、空白对照（10mmol/L Tris-HCl缓冲液)等。如果采用荧光定量PCR仪检测产物，还需要提供探针、荧光染料等试剂。所需仪器根据产物检测方法而不同，主要包括电泳仪、普通或者荧光定量PCR仪、凝胶成像系统等。该实验操作步骤较为简单，主要分为PCR扩增和产物检测两步，其中产物检测主要使用琼脂糖凝胶电泳。也可以使用荧光定量PCR法将两步同时完成。以下以检测肿瘤组织中 EGFR突变为例详细说明操作过程。

PCR反应液（包括特异性引物、探针、dNTP的混合物)， Taq DNA聚合酶，阳性质控品，空白对照液。

离心机，涡旋振荡器，加样器，荧光定量PCR仪。

1)样本先经过病理切片观察，挑选肿瘤细胞大于50%的石蜡包埋样本；

2)使用核酸提取试剂盒完成DNA提取，需达到以下质量要求：OD ₂₆₀/ OD ₂₈₀=1.8±0.2，OD ₂₆₀/OD ₂₃₀≥1.7，浓度：5～15ng/μl。

1)先将各种试剂解冻并离心，根据待测样本的数量计算需要使用的试剂量，注意每次实验都需要设置阴性和阳性质控品组，每组均需要检测内参基因和目标基因；

2)首先将样本与 Taq酶混匀，吹打后进行短暂离心，然后迅速与PCR反应液混匀，并离心，加样过程中要注意防止交叉污染。

3)上机：根据探针标记的荧光，在Real-time PCR仪上选取相对应的荧光通道，设置如下反应程序（表2-2)，进行检测；

1)阴性质控品必须无扩增，否则说明有核酸交叉污染；

2)阳性质控品需要有扩增，否则说明实验失败；

3)内参基因必须有扩增，并且Ct值需要在合理范围之内，否则说明样品浓度过高或过低；

4)在以上基础上，样品中的突变位点检测有扩增，并且Ct值小于阴性临界值，说明突变结果为阳性，若样品中的突变位点检测无扩增或者有扩增但是Ct值大于阳性临界值，说明突变结果为阴性，若Ct值在二者之间需要重复实验。

该方法可以用于检测各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于检测突变比例比较低的体细胞突变。但对于一个位点存在多种突变的SNP，因为要设计多条引物，检测过程比较复杂。当前已经有大量SNP使用该方法进行检测，并且有部分商业化的试剂盒提供，比如 EGFR的突变检测，就可以使用该方法。

该技术为基于杂交原理的一种分型方法，但同时也综合了5′端核酶活性和荧光等技术。它的反应过程使用4条寡核苷酸链，其中两条为等位基因特异的探针，两条为扩增包含SNP区域的PCR引物。两条探针分别设计为与突变型和野生型模板互补，其两端分别使用报告基团和淬灭基团的染料进行标记，不同基因型的探针其报告基团荧光染料不一样，以便于检测。由于探针较短，没有与模板进行配对的探针报告基团和淬灭基团在空间构象上位置临近，由于荧光能量传递的关系，保持荧光灭活状态。在进行SNP检测时，PCR扩增的退火过程，可以导致探针与模板的杂交结合，当引物延伸至探针处时，由于DNA聚合酶的5′端外切酶活性，可以将探针的5′端报告基团从探针上切除，使之与淬灭基团分离，从而释放出相对应的荧光，而没有配对的探针仍然保持完整而不会发荧光。由于不同基因型的探针使用不同荧光染料标记，因此不同的等位基因所发荧光信号不同，通过对荧光信号的检测可以进行基因分型。其具体原理可以参见图2-3。该方法操作过程简单快捷，灵敏度高，分型准确，所需仪器设备较为普及。因此，被认为是中通量基因分型的最佳选择。但该方法所需探针较贵，其精确性对反应条件较为敏感，使得探针设计和实验条件优化较为繁琐。

该实验所需试剂包括检测位点PCR反应液、质控PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs、相应突变位点扩增引物和等位基因特异性探针)、酶混合液（含 Taq酶、UNG酶)、参比染料ROX、内标模板、阳性对照、空白对照（10mM Tris-HCl缓冲液)。所需仪器：荧光定量PCR仪。该实验操作仅需一步，将所有的试剂和待检测模板混合后，使用荧光定量PCR仪完成分型。

该方法可以用于检测各种类型的SNP，并且通量较高，适合对大量样本的相同位点进行分型。同样对于一个位点存在多种突变的SNP，因为要设计多条探针，检测过程比较复杂。该方法适用于中通量基因分型，绝大部分的突变可以使用该方法完成，并且有大量商业化的试剂盒提供。比如， UGT1A1 ^* 6就可以使用该方法进行分型。

RFLP是一种基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列和结构DNA，并对其进行剪切的原理。如果待分型SNP位点在某种限制性内切酶识别序列中，并且不同基因型碱基可以影响酶的识别作用，就可以使用此法。限制性内切酶通常识别双链DNA的某一特定序列，并且在特定位置或者附近将双链DNA切断，从而产生较短的DNA片段。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化就可以导致酶切活性的消失。利用这一特性，若待分型的SNP位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种基因型有酶切活性。因此，对位于限制性酶切识别位点的SNP进行分型时，可以使用包含该位点的PCR产物与相应的限制性内切酶进行孵育。酶切以后的产物进行电泳，可以很容易的根据产物的片段大小来进行基因分型。其具体原理可以参见图2-4。该方法不需要任何探针，也不需要特别的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强。但缺点也很明显，主要是通量太低，大量分型时工作量大，灵敏度和准确度均较差。其原理如下图所示：

该实验所需试剂包括扩增包含检测位点片段的PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs等)、DNA聚合酶、阳性对照、空白对照（10mmol/L Tris-HCl缓冲液)、位点特异的限制性内切酶及其反应缓冲液。所需仪器：PCR仪，凝胶成像系统。该实验操作可分为三步：第一步是PCR反应，用于扩增包含待检测位点的DNA片段；第二步为酶消化过程，将扩增的PCR产物与特异性的限制性内切酶共孵育；第三步为对消化产物进行分析，主要采用的方法是琼脂糖凝胶电泳，根据消化后的片段大小，进行基因型的判断。

该分型方法简单易行，所需仪器设备较为普及。但灵敏度和准确度均较差，限制了其使用。此外，对于大样本的分型，该实验工作量太大。因此，RFLP主要适用于条件不好的实验室开展部分SNP的低通量分型实验。该方法是传统的经典方法，很多位点可以使用该方法进行分型。

HRM是近年来快速兴起的一种新的分型方法，它的基本原理是通过对PCR反应的融解曲线分析，来进行分型。PCR扩增的融解曲线取决于其扩增序列，序列中一个碱基的突变都可以导致双链DNA的解链温度发生变化，通过使用实时荧光定量PCR仪监测这种细微的温度变化，可以知道扩增的序列中是否有突变发生，从而对其进行基因分型。普通的实时荧光定量PCR使用的是SYBR Green I等非饱和荧光染料。该类染料高浓度时对PCR反应有抑制作用，使用的浓度较低，不能占据DNA双螺旋结构中的小沟。当DNA发生变性时，荧光染料分子可以重新结合到双链DNA的空缺位置，从而导致荧光信号不够特异。而HRM分析使用的是LC Green等饱和荧光染料，该类染料在饱和浓度时对PCR反应也没有抑制作用，因此可以高浓度使用，从而全部结合DNA双螺旋结构中的小沟。在双链DNA分子的变性过程中，就不存在荧光分子的重排，其特异度得到大幅提升，因此，溶解曲线细微的变化可以反映扩增片段中碱基的不同。由于一个碱基的突变导致DNA解链温度变化很小，因此该方法对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。

该实验所需试剂包括检测位点PCR反应液、质控PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs、相应突变位点扩增引物等)、DNA聚合酶、阳性对照、空白对照（10mmol/L Tris-HCl缓冲液)。所需仪器：HRM荧光定量PCR仪。该实验操作仅需一步，将所有的试剂和待检测模板混合后，使用荧光定量PCR仪进行反应，通过对融解曲线的分析，判断基因型。

该分型方法成本较低，灵敏度高，可以闭管操作，降低了污染风险。但是对实时荧光定量PCR仪要求比较高，需要特殊仪器设备。适合有该类机器的实验室开展各种类型SNP分型研究。

SSCP是一种基于PCR的经典基因多态检测方法，其原理为利用DNA二级结构的变化来检测基因突变。经过PCR扩增后的待检测DNA产物经过处理可以解链并保持在单链状态，单链分子为维持其稳定性，通过分子间作用力在空间上形成稳定的二级空间构象。该构象由碱基的数量和序列决定，单链DNA中的碱基发生变化，即使是单个碱基的突变也会导致整条链二级构象的变化，该现象称之为SSCP。在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，不同构象DNA的迁移率不同，从而停留在胶上的不同区域。经过显色后，可以被发现，从而反映出DNA序列是否发生了突变。早期的PCR-SSCP主要通过放射性同位素进行标记结合放射性自显影技术显示结果。经过改进后，已经可以通过荧光标记，银染和溴化乙锭等方法直接染色，使该方法大大简化并得到推广。该方法的优点为简单，无需特殊仪器设备，成本较低，灵敏度高，可以检测出一个碱基的突变。其主要缺点为随着片段长度的增加，灵敏度逐渐下降，对大于300bp的DNA片段，不推荐使用此法进行检测。由于DNA分子的二级构象受较多因素影响，确定一个稳定的检测条件比较难。且由于该方法不能确定具体的突变类型以及位置，因此不能对序列进行精确分析。此外，此法通量也较低，基于以上缺陷，目前在临床检验中较为少用。

该实验所需试剂包括扩增包含检测位点片段的PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs等)、DNA聚合酶、阳性对照、空白对照（10mmol/L Tris-HCl缓冲液)，可用于制聚丙烯酰胺凝胶所需的丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED等，也可用于染色所需要的荧光染料、溴化乙锭或者硝酸银等。所需的主要仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统。该实验操作可分为三步：第一步是PCR反应，用于扩增包含待检测位点的DNA片段；第二步为聚丙烯酰胺凝胶电泳，将扩增的PCR产物经过变性后，通过电泳进行分离；第三步为显色，主要通过溴化乙锭、硝酸银或者荧光染料进行。

该分型方法简单易行，成本低廉，所需仪器设备较为普及。但分析片段较短，不能对序列进行精确分析，通量较低，限制了其使用。因此，SSCP主要适用于硬件设备较差的实验室开展SNP的低通量分型实验。

数字PCR被认为是第三代PCR技术，它可以直接对目标分子进行计数，是一种绝对定量的PCR方法。随着人们对突变检测灵敏度的要求越来越高，尤其是对肿瘤组织稀有体细胞突变的检测，需要将灵敏度精确到单个分子，传统PCR技术往往不能满足该要求。数字PCR通过将待测样本进行极限稀释，从而使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行PCR扩增。由于每个拷贝的DNA分子都单独进行反应，混杂在大量野生型中的突变也可以产生一个非常明显的突变信号，从而使其灵敏度很高，可以检测到低至一个拷贝的突变。不同于传统的荧光定量PCR，该方法不需要制作标准曲线，不进行Ct值的计算，不受扩增效率的影响，通过泊松分布统计，直接对每个反应室的产物进行定量分析，是一种误差较小的绝对定量方法。原始的数字PCR操作较为复杂，通过引入BEAMing（珠子，乳液，扩增，磁性)技术后，可以将原来分散于微孔板中的反应转移成油包水反应液滴。从而可以实现自动化、快速和高通量操作。根据反应形式的不同，目前数字PCR系统主要有三大类：微孔板、微流体和液滴式。

该实验所需试剂根据反应方法的不同而不同，主要包括PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液和dNTPs)、DNA聚合酶、阳性对照、空白对照（10mmol/L Tris-HCl缓冲液)、反应芯片、突变位点特异性引物和探针。所需仪器设备主要为数字化PCR系统。该实验操作步骤较为简单，主要分为PCR扩增和产物检测两步，其中产物检测主要通过荧光分析。

由于该方法的高灵敏度，主要适用于对微量样本突变的检测，比如母体血液中的胎儿游离DNA，肿瘤患者血液或者粪便中的肿瘤细胞基因组DNA等。

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶催化作用下， S-腺苷蛋氨酸上的甲基转移到胞嘧啶上的修饰反应。它是体内重要的表观遗传学改变，部分基因的甲基化程度与药物疗效相关，因此DNA甲基化检测是个体化治疗的重要检测手段之一。甲基化特异性PCR的基本原理是使用亚硫酸氢钠处理DNA样本时，未发生甲基化的胞嘧啶（C)会发生氧化脱氨基作用，使胞嘧啶转化为尿嘧啶（U)，经过PCR扩增后进一步变为胸腺嘧啶（T)。而发生了甲基化的碱基可以抵抗该种变化，从而使甲基化位点和程度的不同转变为序列的不同，便于进行检测。甲基化特异性PCR需要设计两对引物，分别针对处理后甲基化和非甲基化序列对亚硫酸氢钠处理的DNA进行扩增。若使用甲基化的引物可以扩增出预期片段，说明被检测位点存在甲基化，若使用非甲基化的引物可以扩增出预期片段，说明被检测位点不存在甲基化，若二者均可以扩增出预期片段，说明被检测位点存在一定程度的甲基化。其具体原理可以参见图2-5。该方法简单高效，无需特殊的仪器设备，操作简便，可以对任意位点的甲基化状态进行检测，因此得到广泛的应用。

该实验所需试剂包括亚硫酸氢钠及其处理相关试剂（对苯二酚、乙醇、异丙醇、氢氧化钠、糖原、醋酸铵等)，PCR反应液、质控PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs、相应突变位点特异性引物)、酶混合液（含 Taq酶等)、阳性对照、空白对照（10mmol/L Tris-HCl缓冲液)等。该方法无需特殊的仪器设备：主要使用PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。实验操作主要分为三步：第一步为亚硫酸氢钠处理，将DNA分子中甲基化位点进行转化；第二步为PCR反应，分别用甲基化和非甲基化引物扩增处理后的DNA片段；第三步为PCR产物分析，可以通过聚丙烯酰胺或者琼脂糖凝胶电泳进行条带区分，使用凝胶成像系统进行拍照分析。

该检测方法简单易行，所需仪器设备较为普及，但通量较低。适用于开展低通量检测，比如 MGMT的甲基化程度检测。

基因芯片技术是一项高速、高通量分型技术，该技术的基本原理是杂交。探针和靶序列之间完全匹配和存在错配时，双链DNA的热稳定性不同，基因芯片利用这一原理对其进行分型。一般来说，这种区别主要取决于探针的长度和序列，SNP在探针中的定位和杂交的条件等。其基本原理为首先将与靶序列互补的特异性寡核苷酸探针高密度连接到固相载体表面，一个位点对应多条探针，以提高准确性。靶序列在扩增时被掺入荧光标记，与芯片进行杂交后，芯片扫描仪检测每个杂交信号的强度。完全配对的探针结合效率高，可以释放强的荧光信号，而错配的探针则信号较弱，可以作为交叉杂交的对照，从而对不同基因型进行分型。该方法的最大优点为高通量，但是缺点也很明显包括：灵活度低，很难在已经定制好的芯片中增减或者替换某一特定位点，成本较高，该方法需要的各种仪器设备、试剂都较为特殊，不适合推广普及等。此外，该方法的敏感性和准确性也需要提高。

该实验所需试剂包括检测位点PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs)、荧光标记的相应突变位点扩增引物、DNA聚合酶、阳性对照溶液、杂交液、洗脱液等。所需仪器：PCR仪、芯片扫描仪等。该实验操作可分为核酸扩增、杂交、洗片、读片和结果分析等步骤。其中核酸扩增部分主要是PCR反应，然后将扩增后的产物与芯片进行杂交，洗脱后使用芯片扫描仪对荧光信号进行检测，最后根据信号对结果进行判读。

该技术特别适用于大样本、高通量基因分型，对于小样本分型成本较高，需要特殊仪器设备。

荧光原位杂交是20世纪80年代建立起的一种衔接分子生物学和细胞遗传学的技术，开创了分子细胞遗传学的新学科。该技术起源于放射性原位杂交技术，在其基础上使用荧光标记替代同位素标记，从而发展出来的一种非放射性分子细胞遗传技术。它利用杂交的原理，通过碱基间的互补配对，将荧光标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列。然后通过荧光显微镜观测荧光信号位置、大小及数量来判断待测序列的缺失、扩增及易位等情况。它可以同时分析多个细胞，不需要提取核酸，在检测到信号的同时可以保持原有组织的结构，从而准确地反映组织细胞的功能状态。通过针对不同基因设计特异性探针，FISH可以检测到大多数染色体的重排、易位、倒位等结构改变，通过荧光信号的放大，对待测样本中低含量的靶序列有较高的灵敏度。基于以上优点，该技术在个体化医学临床检测中得到了广泛应用，并成为很多基因扩增或者融合基因检测的标准方法。通过荧光信号标记方式的不同，可以将FISH技术分为直接标记和间接标记两大类方法。直接标记法将荧光素与核酸探针直接相连，经过杂交后可以直接显色；间接标记法将生物素或者半抗原与核酸探针连接，杂交后与荧光素标记的抗体或者抗生物素孵育，再激发荧光。

根据FISH技术的基本原理，该实验主要分为以下几个步骤：①将探针进行荧光标记，然后对待测样本进行加热处理使其DNA发生变性，便于探针的结合；②将探针和待测样本进行共孵育，经过一定时间的处理后，二者发生特异性的结合；③进行显色观察。对于基因扩增的检测为了排除多倍体等干扰因素，需要加入两种DNA探针：一种为检测目的基因位点特异性标记（locus specific identifier，LSI)探针；另一种为参照用的染色体计数探针（chromosome enumeration probe，CEP)。通常选用LSI探针所处染色体的着丝粒位置。下面我们以检测肿瘤组织中 HER2基因扩增为例说明FISH法检测基因扩增的全过程。

LSI HER-2探针（橙色荧光标记)， CEP17探针（绿色荧光标记)，DAPI染液，NP-40，SSC缓冲液，中性甲醛缓冲液（在PBS中配制的4%甲醛溶液)，二甲苯（或其他替代脱蜡试剂)，蛋白酶K，封片剂，不同浓度的乙醇。

防脱载玻片，切片机，烤片机，温度计，无蛋白质的水浴槽，染色缸，恒温水浴箱，原位杂交仪，荧光显微镜，图像采集分析系统。

1)从甲醛固定的石蜡包埋组织中进行切片，厚度为4μm±1μm；

2)将切下来的组织在37℃双蒸水中充分展开，并贴于防脱玻片上；

3)自然晾干后，56℃烤片过夜；

4)同时切另外一张切片，进行HE染色，用于判断肿瘤细胞的位置。

1)与HE染色的片子比对后确定肿瘤细胞的位置，刮去非肿瘤组织；

2)将切片使用二甲苯脱蜡10分钟×3次；

3)使用无水乙醇处理5分钟×3次，并自然晾干；

4)将切片在开水中煮沸20分钟，冷却至室温后使用2×SSC处理，5分钟×2次；

5)将切片在37℃中使用预热的蛋白酶K消化15分钟左右（视组织的多少调整消化时间的长短)；

6)消化后的切片在室温使用2×SSC处理，5分钟×2次，并自然晾干；

7)室温按顺序分别使用70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各处理3分钟，自然晾干。

1)将探针从冰箱拿出并解冻，取10μl加至杂交组织中央处，注意调暗室内灯光；

2)立即加盖盖玻片，用封片胶封边，放入湿盒后使用杂交仪进行杂交，程序设置为75℃ 5分钟，37℃ 14～18小时杂交过夜。

1)杂交完后，去除封片胶，同时预加热洗液（含0.3%NP-40的2×SSC)温度至72℃ ±1℃；

2)将切片置于室温的洗液中处理数分钟，待盖玻片自行滑落；

3)将切片置于预热的洗液中处理2分钟，然后取出玻片并避光晾干；

4)每张玻片加上10μl的DAPI复染液，立即盖上盖玻片，并封片；

5)将玻片置于-20℃冰箱长期保存，或者30分钟后进行阅片。

1)首先对杂交结果的有效性进行评估，杂交信号应该明亮、清楚且易于观察，背景应该为黑色且无荧光颗粒和背景干扰；

2)细胞内无或者只有一种荧光信号，不应计数；

3)计算至少20个细胞核的橙绿信号比值，比值<2.0，则认为未观察到 HER2基因扩增。比值≥2.0，则认为观察到 HER2基因扩增。如果比值在临界值（1.8～2.2之间)，需再增加计数20个细胞核并重新计算该比值，并要求由另一名技术人员重新判读，以进一步验证该结果。

由于FISH技术的精确性和高灵敏度，可检测染色体数目异常、基因扩增、缺失、重排等多种异常，其在个体化治疗临床检验中有广泛的应用。包括遗传性疾病的包括遗传性疾病的产前诊断和筛查，血液和淋巴系统肿瘤的诊断，分子靶向药物作用靶点的检测等。比如乳腺癌的 HER2基因扩增，非小细胞肺癌的 ALK基因融合等，都已经有成熟的商品化试剂盒提供。

CISH是一种介于FISH和免疫组化之间的方法，其基本原理与FISH类似，都是用特异性探针与目的片段进行原位杂交，来检测样本中是否存在基因扩增、缺失、断裂等异常，两者的不同之处在于探针信号标记的方法。FISH使用荧光染料标记特异性探针，用荧光显微镜观察杂交信号，而CISH基于显色原理，与免疫组织化学的显色方法类似。首先用地高辛或生物素标记特异性探针，然后利用抗体标记的辣根过氧化物酶与抗地高辛抗体结合，加入底物使之显色，该杂交结果在普通光学显微镜下就可以进行观察。早期的CISH使用单色探针，但由于特异性较差，后来发展为地高辛和DNP标记的双色探针。因为没有使用荧光信号进行标记，因此该实验操作简单，信号比较稳定，可以直接在普通光学显微镜下进行结果判读。待测样本还可以用苏木素染色来观察组织细胞的形态变化，无需另外制作HE染色对照片，结果比较容易判断，染色后的信号不会像荧光信号一样产生衰减，因此切片可以在室温下长期保存。此外，该方法成本较低，易于推广。

与FISH比较，两种实验的制片，脱蜡，杂交前处理，杂交等过程基本一样，不同之处在于CISH使用显色反应代替了荧光。需要使用的试剂主要包括标记的探针，NP-40，SSC缓冲液，中性甲醛缓冲液（在PBS中配制的4%甲醛溶液)，二甲苯（或其他替代脱蜡试剂)，蛋白酶K，封片剂，不同浓度的乙醇，苏木素，底物显色液等。需要的仪器设备主要包括防脱载玻片，切片机，烤片机，温度计，无蛋白质的水浴槽，染色缸，恒温水浴箱，原位杂交仪，光学显微镜等。实验步骤主要包括脱蜡，杂交前处理，酶消化，变性，杂交，杂交后洗涤和免疫显色。其中前期流程与FISH一致，免疫显色的流程与免疫组织化学流程一致。

该方法简单实用，对于部分检测项目可以替代FISH，比如 HER2基因扩增的检测，美国FDA已经批准了使用CISH进行检测的试剂盒，比较适合由于成本或者仪器设备原因不能开展FISH的实验室。

CE指一类以毛细管为分离通道，通过高压电场驱动进行液相分离的技术。目前最新的技术称为高效毛细管电泳（HPCE)。CE主要基于电泳理论和电渗理论。电泳即带电粒子在电场作用下的定向移动。CE使用的分离通道为石英毛细管柱，该管柱在pH>3的情况下内表面带负电，因此与溶液接触时会形成双电层。毛细管在高电压场的作用下，双电层中的水合阳离子会引起流体整体地由正极朝负极方向移动，这种现象叫电渗。在电渗和电泳两种作用的驱动下，带电粒子在毛细管内电解质中的迁移速度会因粒子的电性不同而不同，从而实现各种粒子的分离。例如带正离子的粒子电泳运动方向与电渗所产生电渗流的方向一致，会最先流出；中性粒子无电泳速度，因此它的迁移速度与电渗流的速度相同，将第二个流出；带负离子的粒子电泳运动方向与电渗流方向相反，当电渗流速度大于电泳流速度时，它们将在中性粒子之后流出。在核酸检测领域，CE主要用于核酸片段长度的检测。检测前将核酸片段进行荧光标记，然后进行CE记录时间并检测荧光强度即可判定该片段长度。

首先将待检测的核酸片段进行荧光标记然后PCR扩增。扩增完成后取适量PCR产物、分子内标和缓冲液在遗传分析仪中进行CE。记录荧光信号并通过软件进行图像收集和分析确定待测片段长度。CE的步骤比较简单，通常包括：毛细管清洗、更换缓冲液、进样和电泳4个步骤。

该方法简单实用，在临床上主要用于微卫星不稳定性（MSI)检测。MSI检测的标本通常为同一患者的血液和肿瘤组织标本。检测前将血液和组织DNA中特定的微卫星位点进行荧光标记并进行PCR扩增，然后通过对比血液和组织DNA中微卫星位点扩增产物在CE过程中的荧光情况，来判定微卫星位点的稳定性。目前MSI检测已被纳入美国国立综合癌症网络（NCCN)结直肠癌治疗指南，结直肠癌患者可更具MSI检测结果实施个体化的治疗方案。

焦硫酸测序是1996年由波尔·尼伦和穆斯塔法·罗纳吉在瑞典斯德哥尔摩的皇家工学院发展出来的一种新型DNA测序方法。该方法主要基于4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。这4种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷腺苷双磷酸酶。测序所需的反应体系除了4种酶外还包含5′-磷酰硫酸、荧光素、待测模板和测序引物。在进行测序时，测序仪将依次向反应体系中过量加入一种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)，如果该dNTP与待测模板结合生成焦磷酸，焦磷酸与ATP硫酸化酶作用生成ATP，ATP和荧光素在荧光素酶的催化下可生成可见光，测序仪捕捉并记录可见光的信号，多余的dNTP将被三磷腺苷双磷酸酶降解，随后开始下一个循环；而如果加入的dNTP没有与模板结合将被直接降解，不会产生可见光。测序完成后通过光信号图和dNTP加入的顺序即可判定待测模板的碱基序列。焦磷酸测序只能进行单链检测，因此在测序前需进行单链模板的制备。单链模板制备主要基于生物素与链霉亲和素磁珠的偶联反应。在对目的片段进行PCR扩增时，有一条引物预先采用生物素标记。扩增完成后将链霉亲和素磁珠与PCR产物偶联，吸附磁珠，随后进行变性和洗涤。没有被生物素标记的单链将被洗脱，被标记的单链被磁珠吸附得以保留。

焦磷酸测序主要包含PCR扩增、单链模板制备和上机测序三个步骤，这里重点介绍后两个步骤，具体实验流程如下：

焦磷酸测序试剂盒（4种dNTP、底物和酶)；结合缓冲液（binding buffer)；链霉亲和素磁珠；退火缓冲液（annealing buffer)；测序引物；双蒸水；70%乙醇；变性缓冲液（denaturation buffer)；洗涤缓冲液（washing buffer)。

焦磷酸测序仪；真空准备工作站及其配套真空泵；96孔板振荡器；电脑；恒温箱；冰箱；移液器。

1)在8连管中每孔加入65μl包含磁珠的结合缓冲液；

2)每孔加入一个待测样品的DNA模板，一般为15μl；

3)将加入溶液的孔盖上8连管盖，然后置于96孔板振荡器上振荡10分钟；

4)取一个焦磷酸测序反应板，每孔中加入15μl退火缓冲液和1μl测序引物；

5)在真空预装工作站中对应的孔中分别加入双蒸水、70%乙醇、变性缓冲液、洗涤缓冲液，并在相应位置安装好焦磷酸测序反应板；

6)振荡完成后将8连管置于真空预装工作站相应插槽内并取下管盖；

7)打开真空泵及真空预装工具开关，将工具置于真空预装工作站中加入水的孔中洗涤30秒，然后放入8连管中抓取磁珠，磁珠抓取完成后分别在70%乙醇、变性缓冲液、洗涤缓冲液中洗涤5秒、8秒和15秒；

8)将真空预装工具置于焦磷酸测序反应板之上，关闭真空泵及真空预装工具开关，并将工具置于反应板中对应的孔中充分振荡摇晃以释放磁珠；

9)将焦磷酸测序反应板置于80℃恒温箱中2分钟，然后冷却至室温。

1)打开软件，选择新建项目，设置测序反应板基因型检测的内容，并记录试剂仓中各试剂加入的体积；

2)将新建项目文件保存至U盘中，并取下U盘，接入焦磷酸测序仪；

3)在试剂仓对应的孔中根据前面记录的加入量分别加入4种dNTP、底物和酶。

4)打开仪器仓，将试剂仓和测序反应板置于相应的位置固定好并关仓；

5)将U盘连接至焦磷酸测序仪，点击run，然后选择之前新建的项目文件，点击yes开始测序，时间为30～60分钟；

6)测序完成后将U盘取出，并连接至装有软件的电脑，打开结果文件后点击analyze开始分析结果，读取测序结果。

该方法简单实用，重复性和准确度较高，灵敏度适中（5%)，可进行定性和定量检测，但可检测片段较短（50bp左右)，常用于SNP分型、单位点或短序列的插入缺失体细胞突变检测以及病原微生物检测。市面上的焦磷酸测序仪根据其检测通量可分为可检测24孔的测序仪和可检测96孔的测序仪。目前国家食品药品监督管理总局（CFDA)已批准了PyroMark Q24（24孔版本)及部分适用于该仪器的SNP检测试剂盒用于临床检测。

Sanger法测序是弗雷德里克·桑格于1977年发展出来的全球第一种用于DNA测序的方法，该方法的开发使得桑格获得了1980年的诺贝尔化学奖，是人类基因组计划实施的基础。Sanger法测序主要基于桑格发明的双脱氧链终止法（chain termination method)和PCR反应。在Sanger法测序时，会加入4种dNTP和一定比例的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)进行测序PCR。与dNTP相比ddNTP缺少延伸所需要的3′-OH基团。通常情况下待测模板会在DNA聚合酶的作用下不断延伸，但由于ddNTP的加入，该延伸可能随机在A、T、G或C处终止，从而产生以A、T、C、G结尾的四组不同长度的核苷酸。由于4种ddNTP被4种不同颜色的荧光标记，因此将延伸反应产物置于尿素变性的PAGE胶上电泳并进行荧光检测即可根据电泳时间和荧光信号的出现顺序获取DNA碱基序列。

Sanger法测序主要包含PCR、PCR产物纯化、PCR产物测序、测序PCR纯化和电泳五个步骤，这里重点介绍后四个步骤，具体实验流程如下：

【主要试剂】纯化试剂盒（溶胶/结合液、漂洗液、洗脱液、3mol/L醋酸钠、异丙醇、吸附柱、收集管等)；测序引物；Bigdye v3.1；ddH ₂ O；POP7胶；ABC（阳极缓冲液)；CBC（阴极缓冲液)；Hi-Di（去离子甲酰胺)

【仪器设备】Sanger测序仪；高速冷冻离心机；桌面离心机；电脑；冰箱；移液器。

【实验步骤】（1)单链模板制备（柱纯化法)

1)取100μlPCR产物与500μl溶胶/结合液充分混匀；

2)将吸附柱放入收集管中，然后将混合溶液转移至吸附柱内，室温放置1分钟；

3)12 000rpm离心1分钟，取出吸附柱，弃去收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管；

4)在吸附柱中加入漂洗液700μl，12 000rpm离心1分钟，取吸附柱，去废液，再放回吸附柱，重复两次；

5)12 000rpm离心2分钟，取出吸附柱至另一干净离心管，在吸附膜中心位置加入50μl洗脱液，室温放置2分钟；

6)12 000rpm离心1分钟，将得到的洗脱液再次加入吸附柱，再次进行12 000rpm离心1分钟。

（2)PCR产物测序

1)配置PCR产物测序反应体系（标准)，配方如下：纯化后的PCR产物（200～500bp，10ng/μl)1μl、引物（0.8～3.2pmol/μl)4μl、BigDye（2.5x)8μl、ddH ₂O 7μl；

2)设置PCR循环条件，条件如下：96℃ 1分钟、（96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 4分钟)×25循环、4℃ 保温；

3)开始测序PCR。

（3)测序产物纯化（酒精/EDTA/NaAc法)

1)每管加入2μl 125mmol EDTA（pH=8)，2μl 3mmol NaAc（pH=5.2)，加到管底；

2)加入50μl 100% 酒精，封严，振荡4次，室温放置15分钟；

3)3000×g 4℃离心30分钟，马上倒置96孔板，185×g离心1分钟；

4)加入70μl 70%酒精，3000×g 4℃离心15分钟，马上倒置96孔板，185×g离心1分钟；

5)70%酒精重复洗涤1次或2次，让残余的酒精在室温挥发干。

（4)电泳：加入10μl Hi-Di甲酰胺，95℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上样电泳。

Sanger法测序为DNA序列检测的金标准，该方法操作简单，测序成本低，重复性和准确度均较高，可检测片段长（500～1000bp)，但灵敏度较低，仅为20%。目前，Sanger法测序常用于SNP分型、片段较长的插入或缺失突变（包括ARMS-PCR和焦磷酸测序无法检测的体细胞突变)及高通量测序突变结果验证。目前CFDA已批准了Thermo公司的3500 Dx和3500xL Dx系列基因分析仪用于临床检测。

随着现代医学和生物学的不断发展，人们发现遗传因素在疾病的预防、发生和发展过程中起到重要作用，对于基因组信息的渴求愈发强烈。一代测序低通量、高成本的问题不断被放大，新的测序技术亟待开发。在这种背景下，二代测序技术应运而生。2005年瑞士罗氏公司（Roche)推出了全球第一台二代测序仪——454测序系统，随后美国Illumina公司和美国Applied Biosystems公司也相继推出自己的二代测序仪，标志着人类进入高通量测序时代。这些公司的测序技术各不相同，但都具有智能化、高通量、大规模平行检测的特点，因此被统称为二代测序或下一代测序（Next generation sequencing，NGS)。NGS的出现使得DNA测序的费用大幅下降为此前的1%，极大地推动了基因组医学的发展，让基因组测序更加贴近普通民众。目前市面上最广泛使用的二代测序仪包括 Thermo fisher的 Ion Torrent系列和 Illum ina公司的Hiseq系列。本部分将重点介绍这两种测序技术的原理和工作流程。

Ion Torrent是一种基于半导体芯片的测序技术，它最早由Life Technology开发，后来被Thermo fisher收购，目前属于Thermo fisher的主推二代测序产品。Ion Torrent技术使用的高密度半导体芯片上布满了小孔，每个小孔为一个测序反应池，构成一个单独的测序反应体系。与焦磷酸测序原理类似，进行Ion Torrent测序时，每次加入一种过量的dNTP。当DNA聚合酶把dNTP聚合到延伸中的DNA链上时会释放出H ⁺，因此反应池中的pH会发生变化。位于反应池下的离子感受器感受到此变化并将它与dNTP释放的信号相结合转化为数字信号，即可读出DNA序列。相比于一代测序只能检测单一片段或少量的多片段，Ion Torrent测序技术可开展全基因组测序或者多区域的靶向测序（如全外显子测序)。进行全基因组测序时，要先进行DNA文库构建。提取待测样品的DNA后，将基因组DNA进行物理打断。打断完成后连接接头并进行片段大小筛选，筛选出100～400bp长度的片段。将筛选出的片段变性连接到水油包被的磁珠（每个磁珠只含有一种DNA模板)，然后进行油包水PCR扩增，即完成文库构建。油包水PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。文库构建完成后需进行文库定量，文库量过低导致测序得出的数据量低从而结果不可靠。定量完成后将富含单一DNA模板的磁珠装载到半导体芯片的孔中，每个孔仅能容纳一个磁珠。装载完成后即可开始后续的测序过程。靶向测序与全基因组测序仅在文库制备过程中存在差异。靶向测序得到DNA模板片段的方法不是物理打断而是多重PCR，利用多对引物在同一PCR反应中进行扩增，得到多个目标核酸片段。

Hiseq系列测序系统是目前全球使用量最大的第二代测序系统，该系统主要采用边合成边测序的方法。与Ion Torrent测序技术相比，在测序时Hiseq测序系统也需要进行DNA打断、片段筛选、连接接头和定量等工作，不同之处在于Hiseq测序系统不需要磁珠，测序时使用被称为流通池（Flowcell)的芯片而不是布满了小孔的半导体芯片，DNA模板的扩增和测序都在Flowcell上完成。每个Flowcell上包含8个泳道（lane)，每个lane表面附有很多成对存在的接头，这些接头可以跟加载DNA模板的接头互补结合。文库构建好后将文库流过Flowcell，DNA模板会随机的与lane表面的接头结合附着在lane的表面。然后利用桥式PCR扩增原理不断的扩增和变性循环（约35个循环)，这样每个DNA模板都将在各自的位置上集中成束（cluster)，每个cluster都含有单个DNA模板及其互补链的多个拷贝。通过化学处理去除掉一条链以后即可开展测序。桥式PCR的目的是将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。测序时向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头测序引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP进行互补链合成。这些dNTP的3′端添加了阻滞基团，因此在测序时当dNTP被添加到合成链上后不能继续延伸。所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶将被洗脱。接着加入激发荧光所需的缓冲液并用激光激发荧光信号。光学设备记录荧光信号，然后通过计算机分析将荧光信号转化为测序碱基。荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3′端的阻滞基团，以便开始下一轮的循环。

大多数二代测序的操作步骤都大同小异。主要包括：文库构建、文库定量、上机测序、数据分析四个步骤。不同的测序技术及适用于该技术平台的不同试剂盒在这些步骤上的方法和要求上可能有所差异。主要仪器设备包括：二代测序仪，96孔板离心机、微型离心机、96孔板式磁力架、移液器、1.5m l试管架和涡旋混合器等。

二代测序检测通量大、重复性和准确度较高，目前主要适用于多基因位点的突变检测（点突变、插入缺失突变等)，在临床上主要用于肿瘤靶向用药基因突变检测，肿瘤易感性基因突变检测等。此外，二代测序还能对NCCN指南中包含的一些融合基因进行检测，如 ALK、 ROS1、 RET等。融合基因检测的对象为患者肿瘤组织中的RNA。从肿瘤组织中提取RNA后逆转录成cDNA，然后再构建文库上机测序。

近年来测序技术不断飞速发展，在二代测序刚开始普及时，三代测序技术也悄然进入市场。与前两代测序技术相比，三代测序技术最大的特点是单分子测序，无需进行PCR扩增即可测序。目前最具代表性的三代测序技术包括PacBio的单分子实时测序技术和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术。

单分子实时测序技术也应用了边合成边测序的思想，其基本原理是四色荧光标记dNTP在DNA聚合酶的作用下和模板结合，不同dNTP的加入，可激发出不同荧光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。单分子实时测序技术的关键问题是如何区分反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景。为了最小化荧光背景的干扰，单分子实时测序技术利用了零模波导孔原理。该技术将待测单链置于零模波导孔中，该导孔外径比检测激光波长小，因此检测激光不能穿过该孔激发游离碱基的荧光，但可以覆盖检测区域，从而将反应信号与荧光背景区分。单分子实时测序技术测序速度很快，每秒可检测约10个dNTP。该技术还使用了特殊处理的DNA聚合酶，因此具有超长读长。此外，该技术还可以直接检测DNA甲基化而无需通过重亚硫酸盐转化。该技术检测碱基修饰主要通过相邻两峰的测序时间来判定，如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间距离增大。该技术目前最大的问题是测序错误率高达15%，不过这种错误是随机出现，可以通过多次测序进行纠错。

纳米孔单分子测序技术是基于电信号的测序技术。该技术设计了一种特殊的纳米孔，纳米孔置于含有一对电极的脂质双分子层上，孔内结合了一个核酸外切酶。当DNA通过纳米孔时，核酸外切酶会顺序剪切掉穿过纳米孔的DNA碱基，因此每个碱基通过纳米孔时会产生一个阻断，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度。不同的碱基对电流强度影响的幅度是不同的，采用高精度电子设备检测这些变化并将它转化为相应的碱基就能直接读取DNA序列。纳米孔单分子测序技术读长长、通量高，也可以直接读出碱基修饰，目前测序的错误率介于1%～4%。但由于该技术采用了水解测序法，DNA模板在测序过程中直接被水解，因此不能进行重复测序，目前还难以达到一个满意的测序精确度。

与二代测序类似，三代测序也可用于基因组测序、表观基因组检测以及基因突变，但还有很长一段路要走。

MALDI-TOF-MS是一种广泛使用的通过生物分子质量来对其进行分离的方法。这些分子可以包括核苷酸、多肽、蛋白等。该方法具体原理为利用一种称之为基质的有机小分子，该分子可以吸收离子激光的能量。当待分析的样品与基质混合并形成共结晶后，基质可以从激光中吸收能量传递给生物分子，使结合后的分子发生电离。产生的离子在电场作用下加速通过飞行管道，它们的质量和所带电荷可以影响其飞行时间，因此，根据它们到达检测器飞行时间的不同对待检测物进行分离。使用MALDI-TOFMS进行基因分型时，可以同时对多种寡核苷酸进行快速而准确的区分，而不需要对其进行任何标记，因此该方法得以广泛应用，其原理可以参见图2-6。具体操作过程中，该方法包括PinPoint，MassEXTEND，SPC-SBE和GOOD法等。PinPoint法使用ddNTP对引物进行一个碱基的延伸，然后通过质谱进行区分。它不用对核苷酸或者引物进行任何化学修饰，是最简单的方法。缺点是分辨率不够高，尤其对于A/T杂合子的分离效果有限。但有使用质量标记的ddNTP来增加等位基因之间质量区别的方法，可以增加该方法的灵敏度。MassEXTEND法使用ddNTP和dNTP的混合物来进行引物延伸，这样可以增加延伸后产物之间的质量区别，从而增加基因分型的准确率。MassEXTEND现在已经可以使用Sequenom公司开发的MassARRAY平台来进行自动化的高通量基因分型，是当前使用最为广泛的质谱基因分型平台之一。GOOD法使用3′端进行了硫代磷酸酯修饰的引物，在α- S-ddNTP参与的情况下产生电荷标记的DNA片段。电荷标记的好处是可以减少质谱分析前产物纯化的过程，并且使用更短的片段可以提高分辨率。SPC-SBE法则使用生物素标记的ddNTP（biotin-ddNTPs)来进行引物延伸，从而产生3′端有生物素标记的DNA片段，在进行质谱分析前很容易使用streptavidin包埋的磁珠进行分离。该方法灵敏、准确、通量高，并且具有自动化数据收集的能力。因此，适合高通量的分型分析。缺点是需要特殊的仪器设备，购置费用较为昂贵。

该方法包括多种反应平台，现以目前使用最为广泛的Sequenom公司MassArray平台为例进行说明。该方法检测所需试剂包括核酸扩增试剂、样品纯化试剂、引物延伸试剂等三大类。核酸扩增试剂包括PCR反应预混液（含dNTP、DNA聚合酶、引物、Mg ²⁺等)，样品纯化试剂包括碱性磷酸酶及其缓冲液、纯化用树脂，引物延伸试剂包括反应缓冲液、酶、延伸用核苷酸等。所需仪器有：PCR仪、质谱分析仪。

该实验操作可分为三步：第一步是PCR反应，用于扩增包含待检测位点的DNA片段；第二步为引物延伸过程，将扩增的PCR产物纯化后与引物延伸试剂共孵育；第三步为质谱分析，将上述引物延伸产物与树脂混合进行纯化后，上样到机器里进行分析。最后根据机器对片段大小进行分析后，得出基因型结果。

该方法最大优点为通量高，因此主要用于高通量、大样本的基因分型。由于仪器购置费用昂贵，不适合于小样本的分型。

变性高效液相色谱通过检测在部分变性和完全变性的情况下，DNA分子的移动情况来进行SNP分型。DHPLC在变性情况下检测PCR扩增所得双链DNA的SNP。PCR产物被变性，然后重新退火，形成同源和异源双链，通过色谱柱进行分离。异源双链的稳定性较差，在柱子中保留的时间较短，因此比同源双链洗脱得更快，在色谱图中出现相应的峰。而完全变性条件下的DHPLC可以区分单链DNA中的单个碱基突变。具体来说，该方法为在高压闭合的液相流路中，将DNA样品与缓冲液混合后自动注入DNA分离色谱柱，通过缓冲液的不同梯度和柱温的变化对待检测DNA进行分离，然后通过紫外或者荧光检测分离后的样品。整个过程可以实现自动化操作，该方法优点为所检测的DNA长度变动范围较广，从点突变到大片段插入/缺失和微卫星分析，特异度、灵敏度和通量都较高。主要缺点为可以判断是否有突变，但不能确定SNP的位置和具体类型。此外，需要特殊仪器设备，购置费用较贵。

该实验所需试剂包括检测位点PCR反应液（每种反应液均包含PCR缓冲液、dNTPs、相应突变位点扩增引物等)、DNA聚合酶、TEAA缓冲液、乙腈等。所需仪器：PCR仪和色谱仪。第一步为PCR反应，用于扩增包含待检测位点的DNA片段。第二步为色谱分析，将扩增的PCR产物确定好溶解温度后，与流动相混合，上到色谱仪里进行分析。最后，根据出峰的结果确定基因型。

该方法快速，灵敏，但是不能确定具体突变碱基的具体信息。因此，适合检测对具体碱基信息没有要求的样本检测。

IHC是个体化治疗临床检验方法中较为成熟的实验技术，是很多医院和检验机构的常规开展项目。该方法基于抗原抗体特异性结合的基本原理，通过显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位与抗原结合，然后通过化学反应使显色剂显色，从而检测相应抗原的定位和表达。基于该原理，IHC首先需要有针对待测抗原的特异性抗体，可以将抗原提取并纯化后免疫小鼠、兔或者山羊等动物进行制备，这种抗体称之为第一抗体。如果在一抗上直接标上显色剂则称之为直接标记法，但是由于这种方法信号不强，为进一步放大抗原信号，往往需要用第一抗体进一步免疫动物制作第二抗体，然后在第二抗体标上显色剂，这种方法称之为间接标记法。根据标记物质可以将IHC分为不同类型，包括荧光法、放射性同位素法、酶标法、胶体金法等。目前临床检验中最为常见的方法是免疫酶标法，常用辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷酸酶（AP)进行标记。HRP是使用最为广泛的酶之一，其底物为过氧化物和供氢体，实验过程中常用的过氧化物是过氧化氢，常用的供氢体为DAB（3，3-二氨基联苯胺)。

免疫组化的分类方法较多，如前所述，根据标记物质的种类可以分类，根据实验染色步骤可以分为直接法、间接法，根据连接方式可以分为链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP)法和链霉亲和素-生物素-过氧化物酶（streptavidin-biotin-perosidase complex，SABC)法等。下面以使用SP法检测石蜡包埋肿瘤组织中的蛋白表达为例详细说明该方法的步骤。

PBS缓冲液，0.01mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0)，0.5mol/L EDTA（pH 8.0)，一抗，二抗，SP，DAB，3%过氧化氢溶液，封闭液，不同浓度梯度乙醇，二甲苯，苏木精等。

水浴锅，高压锅，电磁炉，离心机，显微镜，烤片机，染色缸，图像分析系统。

1)脱蜡前先将切片放到60℃烤片过夜；

2)将切片使用二甲苯脱蜡10分钟×3次；

3)使用无水乙醇处理5分钟×2次，然后分别使用95%、80%和70%的乙醇重复该步骤；

4)PBS冲洗2～3次，每次5分钟。

1)使用3%过氧化氢溶液处理切片10分钟，用于灭活内源性的过氧化物酶活性；

2)PBS冲洗2～3次，每次5分钟；

3)将切片置于0.01mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0)中煮沸15～20分钟，然后自然冷却至室温；

4)PBS冲洗2～3次，每次5分钟。

1)在抗体孵育之前需要先封闭，加入山羊血清封闭液，室温孵育30分钟；

2)去除封闭液后，滴加适当浓度的一抗，37℃放置2小时，或者4℃过夜；

3)PBS冲洗2～3次，每次5分钟；

4)滴加适当浓度的二抗，37℃放置2小时；

5)PBS冲洗2～3次，每次5分钟。

1)滴加SP溶液，37℃放置1小时；

2)PBS冲洗2～3次，每次5分钟；

3)将DAB与过氧化氢，PBS按比例混合后用水稀释，取适量滴加到切片上，显色5～10分钟，可以在显微镜下观察以便控制显色程度；

4)自来水冲洗10分钟终止反应；

5)使用苏木精染核2分钟；

6)自来水冲洗10分钟；

7)封片并进行结果分析。

IHC方法成熟、稳定，结果可靠，可以长期保存，不需要特殊的仪器设备，经过图像处理软件的分析后，可以对结果进行定量，因此得到了广泛应用。适合于对药物作用靶点相关蛋白进行检测，比如乳腺癌组织中HER2蛋白的表达，结直肠癌组织中MMR通路蛋白的表达等。