第二章　药物基因组学与个体化治疗决策中的常用检测技术

适当的样本处理是成功开展检测的前提条件，而临床个体化治疗的样本种类繁多，来源较为复杂，需要小心处理。临床样本处理的核心和关键是确保其完整性和样本质量不变，主要步骤包括采集、运输与储存。其中任何一个环节处置不当都有可能引起样本破坏，从而导致无法检测或者结果有误。本节将按照样本处理的流程，重点讲述各个步骤中的注意事项。

个体化治疗检测项目的申请：随着药物作用靶点的不断发现，个体化治疗发展迅速，检验项目更新很快，申请合适的检测项目是采样前准备工作中的重要一环。临床检验实验室需要定期对已开展和待开展项目进行总结和评估，根据患者的反馈信息和最新相关文献制订相应的检测项目。并以申请单的形式进行提供，申请单应该包含足够的信息和说明，便于有资质开具申请单的医生选择合适的项目。由于个体化治疗领域专业性较强并且体系复杂，临床医生对这些项目往往不太了解，因此需要跟临床检验实验室加强沟通，以便帮助医生针对每位患者选择合适的样本和有价值的检测项目，并能合理解释检测结果。患者则应该在了解检测项目后，积极配合医生和实验室，提供申请单所需要的相关信息。

样本采集前需填写送检申请表，提供受检者的必要信息，为临床医生选择适当的检测项目和采取治疗措施提供参考。需采集的信息主要包括以下内容：

（1)受检者常规信息：主要包括样本唯一性编号、申请的检测项目、采样日期、采样时间、受检者姓名、性别、民族、出生日期、样本来源、采样单位、采样人姓名等。

（2)受检者相关临床资料：主要包括身高、体重、疾病诊断、疾病分型分期、合并疾病、用药情况、送检医生姓名和单位等。

送检单到达检验实验室后，收样人员应该进行复核，根据其专业知识与送检单提供的相关信息，对检测项目的合理性进行审核，必要时应该与送检医生讨论。

正确识别患者是获取正确临床样本的前提条件，由于临床工作中患者情况千差万别，有些可能服用了镇静类药物，有些可能临时改变了诊疗地点，有些可能存在感知方面的障碍等等。因此，医护人员在采样前需要仔细核对患者的姓名、送检医院、科室、住院号等相关身份信息，确保所采集样本来源于患者本人。签署知情同意书是开展临床检测前的重要环节，所有受检者均需签署知情同意书。知情同意书应该告知患者所检测项目的目的、意义、基本过程、患者的受益、检测可能给患者带来的不便和风险、项目的不足、检测后剩余样本的去向及保存时间、样本是否可匿名用于科研项目、如何确保受检者的个人隐私（包括医疗记录和医疗数据)得到保护等相关信息。对于有创的检测（比如穿刺活检)，应该备有紧急风险预案。知情同意书是患者行使选择权和医生履行如实告知义务的书面证据，每一名患者均需签署。

由于个体化用药检测的项目大多为分子检测，因此对于采样容器的要求较高。所有的采样材料需为一次性使用，容器也需为一次性、密闭和无菌装置，如果送检的样本为核酸，还必须保证容器无核酸。由于很多样本在后期都需要进行PCR扩增，因此容器不能含有PCR扩增抑制剂，比如在选择抗凝管时，不能使用肝素作为抗凝剂，而应该使用EDTA或者枸橼酸盐。由于PCR扩增对核酸信号有放大作用，因此采样前和采样过程中一定要特别注意防止采样人员的头发、皮肤脱落细胞等物质对患者样本的污染。

由于个体化用药的检测项目较多，涉及多种不同疾病，因此样本来源有多种，主要包括全血样本、组织样本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、穿刺样本等)、口腔拭子和骨髓等。为确保样本采集的质量，避免污染和干扰，临床检验实验室首先需要对各种不同来源的样本采集流程制作相应的标准操作规程（SOP)，并且加强对样本采集人员的培训。此外，患者也应该做好相应的准备，积极配合采样人员在正确的时间采集足够量的样本。下面，将就个体化治疗中常见样本的具体采集要求和注意事项进行详细说明。

应该使用EDTA或者枸橼酸盐抗凝的真空采血管采集全血样本，一般采集静脉血2～3ml，采集后将采血管颠倒混匀数次，保证抗凝效果。并在抗凝管外部标签纸上详细登记好血样信息，包括样本唯一性编号、姓名、性别、采集日期和时间、样本类型和送检医生姓名等。也可用专用采血卡采集，分袋盛放并登记好相关信息。骨髓样本使用注射器采集和保存，同样也应该使用EDTA或者枸橼酸盐抗凝。如果检测目标是细胞内RNA，建议用含RNA稳定剂的采样管进行全血或骨髓样本的采集，或者在采样后尽快将全血或骨髓加入到RNA稳定溶液中。血液样本应该在4℃保存，24小时之内提取核酸可以获得最佳效果，保存一周后DNA获得率会降低15%～20%左右，保存两周后会降低25%～30%左右，室温影响更大，因此应该将样本尽快送达临床检验实验室。并且在运输的途中做好低温处理和包装保护。

组织样本是个体化医学临床检验最常用的样本来源之一，特别是检测肿瘤组织中的体细胞突变、甲基化、mRNA等，必须采集组织样本进行检测。组织样本主要分为以下两种类型：

（1)新鲜组织：是临床常见的组织类型之一，样本采集的大小取决于组织类型以及所含目的细胞的多少。虽然用于个体化治疗检测的组织越大越好，但有时临床往往难以取到大量组织块，比如很多患者只能接受穿刺活检。这时需要根据临床检验实验室的方法灵敏度和组织中包含待检测细胞数来确定采样量，很难准确定义所需的最小样本量。一般情况下，对于细胞含量较多的组织，比如肿瘤组织，20mg样本可提取出10～40μg DNA或RNA，足够满足大部分分子检测的要求。因此，建议无菌条件下取米粒大小（25mg左右)手术或活检组织送检。若采样的是肿瘤组织，要求未坏死肿瘤组织比例不低于50%。获取的组织块应该立即使用无菌生理盐水冲洗2～3次，并迅速置于液氮中冷冻。也可以置于10%中性甲醛溶液中进行固定，由于甲醛对DNA有损伤作用，因此不宜固定太久，一般推荐较小的组织（如活检组织样本)固定6～12小时，较大的组织（如手术切除样本)固定6～48小时。若是进行RNA分析，为防止RNA酶的降解作用，需要使用RNA稳定液保存。采集后的样本同样需要在容器上详细登记好相关信息，包括样本唯一性编号、姓名、性别、床位号、采集日期和时间、样本类型和送检医生姓名等。

（2)石蜡包埋组织：很多用于分子检测的样本经过了石蜡包埋，此时应该送检未经染色的10μm厚白片或者石蜡卷。具体数量需视组织大小而定，一般情况下250mm ²（成人拇指盖大小)的切片可以提取约0.5～1μg DNA。因此建议手术样本送检5～8张切片，穿刺活检样本送检10～12张。此外，还需要送检或者预留一张HE染色（苏木精—伊红染色法)的切片用于判断待测细胞的数量和比例。对于肿瘤组织，应保证含至少200～400个肿瘤细胞，并尽量剔除非肿瘤细胞和组织。肿瘤组织切片应经病理医师审阅，取一片HE染色后显微镜下观察，确保肿瘤组织含量>50%、坏死组织比例<10%，并在对应的白片上画出癌巢，对肿瘤细胞密集区域进行分析。石蜡包埋组织可以在常温下保存和运输，但也应该尽快送检，以免出现抗原和细胞损伤的情况。同样，送检切片或者石蜡卷需标注好相关信息。

由于采集过程简单，无创，安全，卫生，快速，无需特殊仪器设备，并可自行采集，口腔脱落细胞已被广泛用于DNA和RNA分析。目前较为常用的是口腔拭子，采样前先用清水漱口，清洁双手，采样过程中一定要避免接触棉签，然后用医用消毒棉签伸进口腔，在口腔内侧脸颊黏膜处左右反复擦拭15～20次左右，取出棉签，将棉签置于干净滤纸上自然风干，以同样的方法采集5～6根。棉签立即放入干净封口塑料袋内封闭并放入纸质信封，并在信封上登记相关信息。

胸腹部的部分疾病（比如肿瘤)可以导致异常胸腹水的产生，并且含有部分脱落细胞，可以用于进行个体化治疗的分子检测。其采样过程为穿刺抽取积液，首次抽取时要弃掉第一管样本和注射器，换用新的后留取中段液体于带盖的无菌、EDTA抗凝容器中。临床检验实验室在收到样本后应该离心获取细胞块，然后进行石蜡包埋。后期处理与石蜡包埋的穿刺活检组织一致。

样本运输是样本处理过程中的重要环节，由于很多样本采集的地点与开展临床检验的实验室相隔较远，因此要特别注意避免在此过程中发生样本损坏，下面将就具体的注意事项予以详细说明：

1.常规注意事项

（1)临床检验实验室需要针对不同类型的样本运输过程制作相应的标准操作规程（SOP)，并且加强对运输人员的培训。如果依托于快递公司，则应该将样本运输过程中的特殊要求告知公司运输人员。

（2)应该选择可靠、准时的快递公司，以尽量缩短样本在运输途中的停留时间。样本寄出后应尽快告知检验实验室快递单号及相关信息，以便对样本运输情况进行查询和跟踪。

（3)样本运输过程应选用轻质且不易破碎的包装物，并在包装间隙用细碎轻质材料填充，要特别注意对于玻片的保护。对于低温运输的样本，应放置足够数量的冰袋或者干冰，确保样本达到实验室时仍然处于低温状态。

（4)用于核酸检测的样本，要确保样本运输过程中避免暴露于可能导致核酸降解的环境中。

2.不同类型样本注意事项

（1)全血样本：用于DNA分析的全血样本可在室温下放置8小时，或在4℃暂存72小时，运输时包装容器中应同时放入干冰或足够的冰袋，以确保样本送达时仍维持在低温环境。用于RNA分析的血液样本应用干冰进行运输，且在提取RNA前避免解冻；加有RNA稳定剂的血液样本要求迅速冻存或在采样后4小时内完成RNA提取。干血迹样本也可用于DNA分析，但此类样本干燥后不宜放置在潮湿、密闭的袋子中，以免引起微生物生长。若放置在塑料袋或容器中，应在容器中放置干燥剂除湿。干血迹样本可在常温条件下运输，多个样本一起运输时，需用玻璃纸或纸质盖玻片隔开，以避免相互污染。

（2)骨髓穿刺样本：用于DNA分析的骨髓样本在处理前可在4℃下短时间放置；运输过程应该使用冰袋，并且在72小时内完成核酸提取。若需长期保存，可将去红细胞的骨髓样本在-20℃放置数月。当用于RNA分析时，未加RNA稳定剂的骨髓样本应迅速置于冰上并运送至临检实验室。对于未加RNA稳定剂、不能冻存的骨髓样本，应在采样后1～4小时内完成RNA提取。骨髓样本同样需去红细胞后才能冻存，因为样本冻存与解冻过程中可出现红细胞裂解和血红素释放，后者可抑制PCR。

（3)新鲜组织样本：低温保存的新鲜组织样本应低温运输（内置干冰或冰袋)；一般组织中的DNA在4℃可以稳定保存24小时，-20℃可以稳定保存2周。甲醛固定的新鲜组织样本可以采用常温运输，置于1.5ml EP管内，石蜡封口膜密封，适当固定EP管以防运输时损坏导致漏液。进行RNA分析用的组织样本应用干冰进行运输，且在提取RNA前避免解冻。由于RNA酶在-20℃仍有活性，用于RNA分析的样本尽量保存在-70℃或更低的温度条件下。

（4)石蜡包埋组织样本：石蜡包埋组织块，切片或者石蜡卷可以在常温下运输，应采取措施固定石蜡切片（如切片盒)，以防运输损坏玻片或切片脱落，并置于泡沫盒中运送。

（5)口腔脱落细胞：用于DNA分析的口腔脱落细胞在常温下可保存1周，可在常温下运输。

（6)胸腹水：胸腹水应该使用干冰或者冰袋进行低温运输，样本在-20℃可以存放72小时，长期保存应该去除红细胞后放置于-70℃环境中。用于RNA分析的血液样本应用干冰进行运输，且在提取RNA前避免解冻；加有RNA稳定剂的血液样本要求迅速冻存或在采样后4小时内完成RNA提取。

样本接收和保存是进入临床检验实验室开展检测的第一步，高质量的样本是成功进行后期检测的基础，下面就其注意事项进行详细讲解：

（1)临床检验中心应该针对不同的样本制定相关的接受和拒收SOP，定期对人员进行培训，并安排专人接收样本，接收人在接收样本时应进行仔细检查。首先确认送检样本的相关信息是否完全，送样单和样本是否标识清楚，是否签署了知情同意书。到达时需确认样本是否符合保存条件，是否使用符合要求的容器进行采集、容器有无破损、有无开盖、接收时样本的大致温度，样本量是否符合要求等，样本签收时实行送样人和收样人双签名制度。

（2)对于不符合要求的样本应该拒收，并予以登记。应该针对不同类型的样本制定相应的拒收标准。拒收样本主要包括以下情况：

1)送样单信息填写不完全，不清楚，与标本标识不符；

2)运输和保存条件不符合要求，比如血液或者新鲜组织样本没有使用低温运输；

3)运输所用容器不符合要求，比如血液样本使用肝素抗凝管或其他非密闭、不洁净容器；

4)运输过程中容器有破损或者开盖的情况；

5)运输时间或者运输前标本在外放置时间过长；

6)样本量达不到检测所需最低量要求；

7)同一批送检样本之间有交叉，导致样本不能区分或者有相互污染的可能；

8)血液样本出现溶血；

9)核酸样本浓度、纯度和总量达不到要求；

10)对需要使用白片的组织样本进行了染色；

11)部分实验的组织切片未使用防脱玻片或者切片厚度不符合相关实验的要求。

（3)符合要求的样本签收后应该立即登记样本基本信息、收样日期和时间，并尽快将样本信息录入实验室（或医院)信息管理系统。

不同的样本保存条件不尽相同，下面根据样本类型进行详细说明。

（1)用于DNA检测的血液样本可以在2～8℃冰箱暂存，建议收到样本后24小时内提取DNA，血样保存时间最长不超过72小时。超过该时间应该保存在-20℃以下。用于RNA检测的样本需要存放于-70℃条件下。

（2)骨髓穿刺样本或骨髓穿刺活检样本可以在2～8℃冰箱暂存72小时。进行RNA检测的骨髓穿刺样本应用干冰处理后送达检测实验室。如果样本中没有加RNA稳定剂，需在采样后4小时内完成RNA的提取。如果暂时不提取DNA或RNA，需要先去除红细胞后冻存。

（3)用于DNA分析的新鲜组织样本运抵实验室后，应该立即进行DNA提取或者保存在-20℃，长期保存需放置于-70℃或更低的温度条件。带血的组织样本需先用灭菌生理盐水冲洗后再冰冻保存。组织样本不应放置在无霜冷冻冰箱中，以避免由于冻融循环而导致的核酸降解。用于RNA提取的新鲜组织运抵后应该迅速提取RNA或者保存在-70℃。冻存样本在提取RNA前不应该解冻，应当用异硫氰酸胍缓冲液或其他RNA提取液直接制备匀浆。没有速冻或没有加RNA稳定剂的组织样本应在采样后4小时（最好是1小时)内提取RNA。

（4)用于DNA分析的甲醛固定石蜡包埋组织可在室温条件下放置较长时间。用于免疫组化或者FISH的切片组织，建议尽快处理，因为组织细胞暴露于空气中太久可能导致抗原破坏。不建议用甲醛固定的石蜡包埋组织提取RNA，除非在取不到其他合适样本的情况下。

（5)若送检的为DNA样本时，应放于-20℃保存，长期保存应该置于-70℃。RNA样本应该立即置于-70℃保存，并且避免反复冻融。