第四节　核酸的分离、纯化与鉴定

核酸结构与功能的分析，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸制备过程中需要注意的是要防止核酸降解和变性，同时要尽量使其维持在生物体内的天然状态。通常采用比较温和的条件进行分离，防止过酸、过碱和剧烈搅拌。由于核酸酶无处不在，因此还要特别防止核酸酶对核酸的降解。分离后需要对核酸进行鉴定，包括分子量、紫外吸收、沉降系数、电泳迁移率、黏度等。下面简单介绍实验室常用的核酸制备方法。

一、DNA的分离

真核生物DNA主要存在于细胞核中。细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白（DNP）及核糖核蛋白（RNP）。在细胞破碎后，这两种核蛋白混杂在一起。因此，要制备DNA首先需要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.14mol/L NaCl（生理盐溶液）的稀盐溶液中RNP溶解度最大，DNP溶解度则最小；而在1mol/L NaCl的浓盐溶液中，DNP溶解度增大，RNP溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液反复清洗，所得沉淀即为DNP成分。

分离得到的DNP再溶解，用苯酚、十二烷基硫酸钠（SDS）等蛋白质变性剂使蛋白质变性，再用含有异戊醇的氯仿沉淀去除变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，在有盐的条件下加入2倍体积预冷的无水乙醇，即可把DNA沉淀出来。再用75%的乙醇洗沉淀数次，即可获得纯的DNA。

二、RNA的分离

真核生物RNA大部分存在于细胞质中，而DNA主要存在于细胞核中。因此可只破碎细胞质膜而不破坏核膜使细胞核保持完整，然后通过差速离心实现RNA和DNA的分离。此外，还可通过上述的核糖核蛋白（RNP）与脱氧核糖核蛋白（DNP）在不同盐溶液中溶解度的不同来达到分离的目的。

RNA分子稳定性比DNA要差，同时RNase无处不在，因此分离RNA比DNA更为困难。为了避免环境中RNase对RNA的降解，在实验中需要对所使用的器械、玻璃器皿进行高温焙烤，塑料用具需用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理再高压灭菌，实验中使用的所有试剂和溶液都需用0.1%DEPC配制。对于细胞内存在的RNase，在抽提液中需使用强变性剂使RNase失活，一般采用胍盐（如异硫氰酸胍、盐酸胍）作为变性剂。

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过苯酚/氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，最后溶解即可得到RNA。

三、核酸的鉴定

（一）核酸纯度和浓度的鉴定

从核酸的紫外吸收特性可知，核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm。通过测定在260nm和280nm的A值的比值（A260/A280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8，RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。同时可通过测定其紫外吸收值来计算核酸样品的浓度。在波长260nm时，1A值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA（或RNA）浓度为40μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml。需要注意的是，紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

（二）核酸分子量大小的鉴定

核酸分子量大小的鉴定最简单快速的方法通常采用凝胶电泳来完成。常见的核酸凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者一般分离分子量较大的分子（一般大于100bp）并通过水平电泳槽进行潜水式电泳。后者则用于分离分子量较小的分子（一般小于1000bp）并通过垂直槽进行电泳，它的分辨灵敏度很高，甚至只有单个碱基差异的核酸都可分离开来。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，不同长度的核酸由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。迁移率与核酸分子大小、凝胶浓度、核酸的构象、电场强度等有关。电泳后核酸的相对位置可以通过溴乙锭染色进行测定，溴乙锭是一种扁平分子，很易插入核酸分子碱基之间，经紫外线照射可发射红橙色荧光。根据荧光强度，还可以大致判断DNA样品的浓度。一般情况下可观察到浓度低至纳克级的DNA条带。通过与一系列分子量大小已知的标准DNA（又称为DNA marker）进行比照，即可初步估计待测DNA分子量的大小。

（三）核酸一级结构的鉴定

1. DNA双脱氧链末端终止法

该法由英国科学家Sanger于1977年发明，又称酶法。这种方法经过改进至今仍然是众多实验室中最为常用的DNA序列分析方法。其基本原理是：根据DNA在细胞内复制的原理，使待测DNA解链成为单链模板，加入DNA引物、4种底物dNTP、DNA聚合酶在体外进行子链的聚合，同时在反应体系中再加入2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。这些ddNTP会随机地代替dNTP参加反应。一旦ddNTP加入新合成的DNA子链，由于其3位的羟基脱掉了氧变成了氢，所以不能继续延伸而使链延伸终止。如果不是ddNTP而是dNTP掺入子链中，则子链的延伸得以继续。这样，会合成一系列大小不等的DNA片段。再通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影即可得到测序图。

基本步骤如下：将待测DNA变性解链为单链DNA模板，然后与测序引物在适当的反应缓冲液中进行退火。样品分成4等份，分别进行四个反应。每个反应体系均含DNA聚合酶和4种dNTP底物，其中一种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序（也可对测序引物进行标记，但其成本较高）。在每个反应中除上述成分外，分别加入一种ddNTP（即ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）。在第一个反应中，ddATP会随机地代替dATP参加反应。一旦ddATP加入新合成的DNA链，由于其3位的羟基脱掉了氧变成了氢，所以不能继续延伸而使链延伸终止。第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。同理，第二个反应产生的都是以C结尾的，第三个反应的都以G结尾，第四个反应的都以T结尾。将4管反应物分别加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。每管所在的泳道则分别为以A、G、C或T结尾的不同长度DNA片段。

放射自显影后即可得到测序图谱，从下往上即可读出合成的子链DNA序列，而待测DNA（模板链）序列则为它的互补序列（图2-24）。

2. DNA化学降解测序法

DNA化学降解法由美国哈佛大学的A.Maxam和W.Gilbert于1977年发明。其基本原理是采用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基所参与形成的磷酸二酯键。用4组不同的特异反应，就可以使末端标记的DNA分子切割成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影即可得到测序图。基本步骤是：将单侧末端标记待测DNA样品分成4等份，分别进行下列4组特异反应。

（1）G反应　用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，然后经哌啶处理。哌啶能取代甲基化的鸟嘌呤，导致修饰碱基从脱氧核糖上脱落，进一步导致3'，5'-磷酸二酯键断裂。

（2）G+A反应　用甲酸处理DNA，可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，导致糖苷键不稳定，再用哌啶处理后使磷酸二酯键断裂。

（3）T+C反应　用肼处理DNA，可使C和T的嘧啶环断开，再用哌啶处理后使磷酸二酯键断裂。

（4）C反应　如果肼处理DNA是在高盐浓度下进行，则只有C与肼反应，哌啶处理后使键断裂。

上述样品分别进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影得到测序图谱，从下往上即可读出待测DNA序列（图2-25）。

3. RNA的测序

RNA的测序起源于20世纪60年代。最早由Sanger和Bronlee等建立了RNA序列测定技术。它们的方法是首先将待测RNA分子用同位素标记其一端，然后采用碱基特异的核酸内切酶对待测RNA分子进行特异性切割。如从胰脏提取的RNaseA能特异水解嘧啶核苷酸所形成的磷酸二酯键，所产生寡核苷酸的3'-端均为嘧啶核苷酸；从米曲霉中提取的RNase T1能特异水解鸟苷酸所形成的磷酸二酯键；黑粉菌中提取的RNase U2在一定条件下能特异水解腺苷酸所形成的键；从多头黏菌中提取的RNasePhyM能特异水解A、U两种核苷酸。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切片段，通过放射自显影，从同位素标记端开始逐个确定小片段的顺序，分析各泳道间小片段的相互重叠情况，最后排出整个分子的核苷酸顺序。1965年，Holley用这种方法首次测定了酵母tRNAAla的全序列。

对于真核mRNA分子的测序，由于在其3'-末端都具有多聚A尾结构，因此可人工合成寡聚T引物与其退火，再在逆转录酶催化下逆转录成cDNA，再用DNA测序法来测序。

核酸化学知识框架