第三节　核酸的理化性质及其应用

一、核酸的一般性质

核酸及组成核酸的核苷酸既有碱性基团，又有磷酸基团，因此都是两性电解质，因磷酸的酸性强，通常表现为酸性。

提纯的DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，两者都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。在70%乙醇中形成沉淀，故常用在核酸粗溶液中加入2倍体积乙醇使核酸沉淀的方法对其进行纯化。

DNA分子是线型高分子，因此溶液黏度极高，RNA分子黏度则小得多。当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生螺旋向线团过渡（变性）时，黏度降低，因此可用溶液黏度作为DNA变性的指标。

溶液中的核酸在引力场中可以下沉。在超速离心机形成的极大的引力场下，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的沉降速度与分子量和分子构象有关。应用超速离心技术，可以测定核酸的沉降系数和分子量。测定DNA分子量时，由于黏度很大，应用较稀的溶液。目前多用氯化铯密度梯度沉降平衡超速离心技术研究核酸分子的构象。

核酸分子在生理条件下，戊糖-磷酸骨架中的磷酸基团会发生解离呈离子化状态，因此整个多核苷酸链是一个多聚阴离子。把这些核酸分子置于电场中时，它们会向正极移动。在一定的电场强度下，核酸分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。凝胶电泳就是应用这一原理把不同分子大小的核酸分子进行分离和鉴定的技术，凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法。

二、核酸的紫外吸收性质

核酸分子中的嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，可强烈吸收260～290nm的紫外光，最大吸收峰波长大约在260nm（图2-21），蛋白质的最大吸收峰波长大约在280nm，据此性质，可用紫外分光光度法对核酸进行定性和定量分析。

通过测定核酸260nm与280nm的吸光度（A）值，计算A260/A280的值即可判断待测核酸样品的纯度。纯DNA比值为1.8，纯RNA比值为2.0。如样品中含有蛋白质或其他杂质，则A260/A280的值明显下降。对于纯核酸，只要测出其A260/A280的值即可计算出含量。通常1A相当于50μg/ml的双链DNA，或40μg/ml单链DNA（或RNA），或30μg/ml单链寡核苷酸。

三、核酸的变性、复性和分子杂交

（一）变性

核酸变性指在某些理化因素作用下，DNA双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程。变性只涉及次级键的变化。而多核苷酸链上共价键（磷酸二酯键）的断裂称核酸降解。

凡可破坏氢键，妨碍碱基堆积力作用和增加磷酸基静电斥力的理化因素均可以促成变性作用的发生。由温度升高引起的变性称热变性；由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性。甲酰胺、尿素和甲醛也是核酸变性剂，对单链DNA进行电泳时，常用上述变性剂。

当将DNA的稀盐溶液加热到80～100℃时，双螺旋结构发生解体，两条链分开形成无规则线团（图2-22），一系列理化性质也随之发生改变；变性后的DNA由于碱基对失去重叠，在260nm处的紫外吸收值明显升高（图2-21），这种现象称为增色效应。变性后的DNA黏度降低，浮力密度升高，生物学活性部分或全部丧失。

DNA加热变性过程是在一个狭窄的温度范围内迅速发生的，通常将紫外光吸收值达到最大值一半时所对应的温度称为解链温度（熔解温度），又称为熔点（Tm）（图2-23）。在Tm时，DNA分子内50%的双螺旋结构被破坏。DNA的Tm值一般在70～85℃，DNA的Tm值高低主要与DNA长短以及碱基组成有关。DNA分子越长，Tm值越高；G-C对含量越高，Tm值就越高；A-T对含量越高，Tm值就越低。此外，离子强度越高，Tm值也越高。

（二）复性

DNA的变性是可逆的，在适宜条件下，变性DNA分开的两条单链可重新形成链间氢键，恢复成双螺旋结构，这个过程称为复性。DNA复性后，许多理化性质又得到恢复，如紫外吸收下降（称为减色效应），生物学活性也得到恢复或部分恢复。若将热变性的DNA骤然降温至4℃以下时，DNA两条单链则继续保持分开，称为淬火；若将此溶液缓慢冷却（称退火）到适当的低温，则两条互补链可重新配对而恢复到原来的双螺旋结构。

（三）分子杂交

DNA的变性和复性都是以碱基互补配对为基础的，如果将不同种类或来源的DNA单链或RNA放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定的碱基互补配对关系，它们就有可能形成杂化双链。这种杂化双链可以在不同的DNA单链之间形成，也可以在RNA单链之间形成，甚至还可以在DNA单链和RNA单链之间形成DNA-RNA杂合体。这种现象称为核酸分子杂交（hybridization）。如果杂交的一条链是人工合成的特定（已知核苷酸顺序）DNA或RNA序列，并经放射性同位素或其他方法标记，称为探针。利用杂交方法，使“探针”与特定未知的序列发生“退火”形成杂合体，即可达到寻找和鉴定特定序列的目的。用“探针”来寻找某些DNA或RNA片段，已成为目前基因克隆、基因定位、鉴定分析中十分重要的手段。近年发展起来的基因芯片技术的基本原理就是核酸分子杂交。

核酸分子杂交可以在固相或液相中进行。实验室应用最广的是以硝酸纤维素膜和尼龙膜作为固相支持物的Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。Southern印迹杂交是指将电泳分离的待测DNA片段转移结合到固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。英国爱丁堡大学的E.M.Southern于1975年首创了这一方法。利用Southern印迹杂交可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性和定量及基因突变分析等。Northern印迹杂交是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。Northern印迹杂交主要用于确定特异mRNA的分子大小、是否有不同剪接体，以及检测特异基因在某一组织或细胞中的mRNA表达水平等。