二、药物代谢的研究方法

药物代谢又称生物转化，是药物在体内多种药物代谢酶的作用下，发生化学结构改变的过程，是机体对药物进行处置的一个不可或缺的重要环节。药物在体内的生物转化主要有两个步骤：第一步代谢反应称为Ⅰ相反应，是药物经氧化、还原或水解后连接某些基团（羟基、氨基、硝基和羧基等），使得药物极性和亲水性增强；第二步代谢反应称为Ⅱ相反应，是指原型药物或与Ⅰ相反应生成的代谢产物和体内某些内源性物质（葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等）结合或经甲基化、乙酰化反应，生成极性大、水溶性高的药物代谢产物，使之容易经尿液、胆汁排出体外。

药物经体内代谢的结果主要有两种：其一为失活，即具有药理作用的药物转化为无药理活性的药物；其二为活化，即无药理活性的药物转化为具有药理作用或药理毒性的代谢物，或代谢物仍保持与原药相同的药理活性。药物代谢是影响药物发挥作用及产生活性或毒性的重要因素之一，其在很大程度上决定了大多数药物的药动学特征及生物利用度，同时也会影响药物用药的安全性。FDA要求新的化学实体作为新药上市时不仅要明确其体内代谢动力学特征，而且必须明确其代谢产物。了解药物各成分代谢的体内过程，对新药的研发和临床合理使用具有重要的指导意义。因此，对药物的代谢进行研究是安全、有效、合理用药的前提，其对于研究药物作用机制、药效与毒性、药物相互作用及合理用药等均有重要意义。

中药、民族药由于成分复杂、有效成分与毒性成分不清楚，以及多靶点作用等原因导致其现代化研究推进困难。在实际研究工作中有许多中药、民族药未能在血液中检测出原型药物成分，但药效十分显著，因而推测其可能是经体内生物转化后产生的代谢产物发挥了治疗作用。由此可见，中药、民族药的体内代谢研究是中药药效物质研究的重要内容。通过代谢研究，可以明确中药吸收进入体内的成分及其存在形式，进而阐明其代谢途径和机制，从而初步明确其药效物质。药物代谢的研究方法分为体内法和体外法，二者相辅相成。与体内代谢研究相比，体外代谢研究可排除体内诸多干扰因素，而直接研究代谢酶对底物的选择性，具有快速简便的特点，为体内代谢整体实验研究提供可靠的理论依据。因此，应在体外代谢研究的基础上进一步开展体内代谢研究，从而科学评价药物的代谢特征和规律。

1.体外代谢研究

（1）肝微粒体法　肝脏是药物代谢的主要器官。肝微粒体酶又称为肝药酶，包括了Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶，为促进药物生物转化的主要酶系统。细胞色素P450（CYP450）酶系是肝微粒体混合功能氧化酶系的主要成分。CYP450是一组由许多同工酶组成的超基因家族，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个家族。其中CYP3A4是最重要的药物代谢酶，其介导了50%的药物代谢反应，在药物的肝脏首过效应及药物的生物体生物利用度上占有举足轻重的地位。

肝微粒体是目前应用最广泛的体外代谢模型。通常采用差速离心法从肝脏中提取微粒体。肝组织匀浆后通过先高速（2000×g）后超速（100000×g）的差速离心法抽取肝微粒体成分，再用适当缓冲液悬浮，加入还原型辅酶Ⅱ（NADPH）再生系统后用于代谢研究。代谢反应需要在体外模拟生理温度及生理环境下进行，并对原型药及代谢产物进行测定。

肝微粒体法进行代谢研究的优点是制备简便，代谢过程快，孵育条件易优化，具有公认的亚酶底物、抑制剂，结果重现性好，因此主要用于药物体外代谢途径研究和预测药物在体内的代谢清除特征。一般通过测定药物体外代谢酶促动力学获得酶促反应最大速度（Vmax）和米氏常数（Km），运用合理的药代动力学模型来推断体内药物的代谢清除特征。同时，该方法可用于对药酶的抑制等方面的研究，根据代谢转化的特点，可有目的进行诱导，影响其酶的亚型，使其对底物的代谢选择性更强、转化率更高，因而在实际工作中的应用较为普及。但该方法也存在明显缺点：①由于制备过程完整的结构遭到破坏，在体外孵育体系中易导致非特异性反应；②缺少代谢所需要的完整的酶反应体系，需要加入适量的辅助因子，如NADPH；③由于外侧细胞膜的去除导致转运蛋白和某些代谢酶的丢失，与体内情况的一致性方面存在不足，特别是对于研究肠道代谢的影响较大。由于存在上述不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。

本课题组建立的大鼠和人肝微粒体体外孵育体系，采用混合探针底物，并以UPLC-MS/MS技术检测各探针底物或代谢物，研究荭草、羊耳菊、白及等不同种属苗药体外CYP代谢酶的酶促动力学情况。结果表明，上述苗药对肝药酶具有不同程度的抑制作用，各自的体外代谢特征具有较为明显的差异性。

（2）基因重组代谢酶系模型　利用基因工程及细胞工程，将调控CYP450或其他代谢酶的表达基因、质粒体整合到哺乳动物细胞、大肠杆菌或昆虫细胞中，经细胞培养表达高水平的代谢酶，再经分离纯化获得高纯度的单一代谢同工酶。目前，已应用基因重组P450酶系模型研究药物的体外代谢途径、药物代谢产物的生成及药物的体外清除率等。同时，该模型在确定诱导药物代谢的酶亚型及研究药物-药物间相互作用方面具有独特的优势，可对参与代谢的CYP450各个亚型的作用进行评估，并且可对其代谢的主要动力学性质进行初步的探讨，因而已进一步渗透到药物代谢研究的各个领域。

基因重组CYP450酶系具有分子水平的优势，在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，适合研究代谢领域微观化和细节化的问题，可快速鉴别对药物代谢贡献较大的酶亚型，并可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息，有助于高通量筛选分析及选择性代谢产物的鉴定。但该技术仍存在一些不足之处，包括：①成本较高；②由于各个同工酶在肝微粒体和肝脏中丰度的差别很大，应用纯酶在同一蛋白水平上进行实验获得的各同工酶代谢程度不能代表各酶在体外肝微粒体或体内肝脏的代谢程度；③体外重组酶的实验条件与CYP450所在的体内环境存在很大的差别，故单独应用该模型的实验相对较少。

（3）肝细胞模型　肝细胞模型是通过制备的肝细胞用培养基稀释成一定浓度并接种后，辅以氧化还原型辅酶，置于带有摇床的CO2孵箱中孵育，在模拟生理温度和生理条件下进行代谢研究。原代肝细胞是目前最被认可且被FDA认定的预测药物对CYP450酶的潜在诱导效应的有效工具。目前，应用最多的肝细胞分离技术是Seglen两步灌流法。肝细胞培养方法最常见的是三明治构型原代肝细胞培养。HepG2人肝癌细胞株在形态学上与新鲜的肝细胞具有高度的相似性，尤其体现在代谢酶、转运体和核受体表达上，是一个比较可靠的原代肝细胞替代品，目前常用于药物代谢研究。

肝细胞模型较好地保持了完整细胞的功能，维持了药物代谢Ⅰ相酶和Ⅱ相酶的代谢活性及有关生理辅助因子的浓度，在短时间内基本保持了体内的代谢酶水平，与正常生理状况接近。肝细胞模型在药物代谢途径和消除速率方面与体内具有一定的相关性，可在细胞水平上提供吸收、代谢、转运等综合信息，主要用于研究药物对CYP450酶的诱导和抑制作用，以及研究P450的表达、判断药物的代谢途径和清除率等诸多方面，为药物安全性评价、临床合理用药等提供理想的体外模型和分析手段。该方法的不足之处是：①肝细胞制备技术较复杂；②在细胞培养过程中，部分CYP450难以表达；③体外肝细胞活性仅能维持4小时，不利于储存和反复使用；④丧失了一定的细胞间联系和正常的空间结构。

（4）肠道菌群代谢模型　肠道是口服药物的必经通道。肠道中不仅存在着影响药物吸收的转运体，还含有许多与药物代谢相关的酶，包括消化道上皮细胞存在的结合酶和消化道菌丛产生的酶，这些酶不同程度地影响着药物在体内的存在形式、吸收过程等。因此，肠道对药物的有关代谢作用日益受到重视，其研究方法也在不断改进。

人体肠道寄居着数量庞大、种类繁多的以细菌为主的微生物，其直接参与人体生长发育、营养吸收、生物屏障、免疫调节等诸多方面，统称为肠道菌群（Intestinal flora）。肠道是一个庞大而富有活力的细菌菌群的栖息地。人类肠道中约有100兆个细菌，其中99%以上为厌氧菌，共同构成了肠道的微生物环境。肠道中拟杆菌属、消化链球菌属、螺菌属等专性厌氧菌和乳酸菌及双歧杆菌占优势。肠道细菌可以产生各种代谢酶，主要有水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等。人体的肠道菌群分布特征与大鼠比较相似，其在人的胃、十二指肠、空肠、回肠上部细菌稀少，远端结肠细菌较多。

药物口服进入体内后，与大量肠道菌群接触，使得药物在到达肝脏之前就已经发生了生物转化。目前，中药有效成分的肠道菌群代谢转化研究逐渐已成为受国际关注的课题。研究中药口服后与肠内菌群的相互作用，探讨药物在消化道中生物转化的一般规律，对揭示中药复杂体系在生物体内的转化过程尤为重要，可为中药药效物质基础研究提供依据。

肠道菌群代谢模型最常用的方法是粪便体外温孵法，即将含有肠道菌群的人、大鼠或者其他动物的新鲜粪便与药物共同在37℃厌氧条件下孵育，采用现代分析技术检测药物原型成分及代谢产物，用以分析药物在肠道菌群中的代谢规律和代谢途径。肠道菌群中占99%以上的厌氧菌对黄酮类化合物的转化起到决定性作用，在其生长代谢过程中会产生许多酶。黄酮类化合物在酶的作用下降解，可发生水解、还原、去羟基等反应，转化成相应的酚酸。肠道细菌对黄酮类化合物的代谢作用可以改善其水溶性，从而影响黄酮类化合物的生物利用度。

2.体内代谢研究

（1）模式生物斑马鱼代谢模型　斑马鱼（zebra fish）作为一种模式生物，由于个体小、易于饲养、发育快速、性成熟期短、繁殖力强、胚胎在母体外发育并且透明、易于观察和操作，已经被广泛用于药物研发的各个过程中，包括药物作用靶点的确立、药物筛选、先导化合物的优化、疾病造模和毒理学等方面。

在生物学上，斑马鱼和人类有一定的相似性，都具有独立的如脑、肝、胰、肾、肠、骨、心脏、肌肉等组织器官，以及神经中枢系统、血液、视觉系统等。大多数人类基因和斑马鱼基因直系同源。斑马鱼的全基因组测序已经完成，其基因与人类基因的相似度达到87%，在蛋白质水平上，关键部位的同源性几乎是100%，而且与人类器官在结构、生理、分子水平等方面具有较高的相似性。根据斑马鱼的基因特点及生理特点，可将其作为一个理想的模式生物代谢模型用于药物代谢研究。

目前，人们对于斑马鱼中大部分药物代谢酶基因的表达的研究比较清楚。斑马鱼有CYP450、尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶（UGT）等多种药物代谢酶，以及核受体如孕烷X受体（PXR）、芳香烃受体（AHR）等的表达。CYP和UGT家族中所有基因的表达情况都已阐明。在药物代谢方面，斑马鱼不仅具有上述作为模式动物的一般优点，同时作为体内模型，克服了在体动物实验强度大，样本处理分析困难等缺陷。相比于体外模型，它最大限度保留了在体动物代谢的系统性，其实验结果更具有预测性。

模式生物斑马鱼代谢模型的给药和取样方法与哺乳动物不同。斑马鱼体积太小，口服给药困难，可将药物溶解于斑马鱼所生活的水中。斑马鱼会自主连续地从溶液中吸收药物，药物代谢物也会随着斑马鱼的排泄物被连续地排到水中，进而可通过分析水中的成分变化来掌握药物的部分代谢信息。此外，对整体鱼内成分的分析也能掌握药物在鱼体内的变化情况。因此通过分析药物在斑马鱼体内及体外的变化规律即可较为全面地反映斑马鱼对药物的代谢情况，方法简单可行。

本课题组进行了头花蓼中3种成分在模式生物斑马鱼中的代谢研究，发现3种黄酮类（槲皮素、槲皮苷、金丝桃苷）成分均能在斑马鱼体外药液及体内发生代谢转化。这与头花蓼在大鼠体内的代谢情况基本一致，说明模式生物斑马鱼代谢模型应用于中药、民族药代谢研究的可适应性及合理性。这也有望为中药、民族药复杂体系的代谢研究提供一种简单、高效、系统、模式的新方法。

（2）哺乳动物体内代谢　体内药物代谢研究以大鼠、Beagle犬、家兔等为研究对象，令其口服（或静脉注射等其他给药途径）药物，并在既定时间内，通过收集血液、尿、粪便、胆汁等生理体液和排泄物，以及取出心、肝、脾、胃、肺、肾等进行分析，研究药物在各个部位的代谢过程，分离鉴定其中的代谢产物，包括代谢产物的结构，代谢产物在不同时间内的含量，从而研究代谢产物在体内过程的动态变化，分析药物在动物体内的生物转化规律。此法能全面反映药物代谢的体内整体特征。由于机体成分复杂，加之许多药物在体内代谢，经过一定的生物转化后，其代谢产物的含量较低，更增加了分析检测的难度。

近年来，利用基因敲除（gene knock-out）技术构建的代谢酶基因敲除动物为药物代谢研究提供了一个与人体内环境近似而又基于整体动物水平的高通量筛选模型。目前，已有多种CYP450基因敲除整体动物模型成功构建，并用于在特定CYP亚型基因缺失条件下动物对药物的代谢研究。例如，研究对乙酰氨基酚在CYP2E1基因敲除小鼠和野生型小鼠体内的代谢行为时，发现对乙酰氨基酚的肝毒性很可能是由于CYP2E1在肝脏中形成的活性代谢物所致的。尽管基因敲除动物在药物代谢研究中发挥着重要作用，但目前也存在着建模周期长、转人外源基因的随机性大、传代难而无法大规模生产、供货渠道单一且价格昂贵等问题，使其应用受到了限制。

3.代谢产物鉴定技术　现代分析技术发展迅速，为药物及其代谢产物的分析提供了有力手段。液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术凭借其简便、快速的特点成为代谢物分析中最常用的手段。近年来，随着高分辨质谱技术的发展，其灵敏度与分辨率均得到极大提升。如四极杆-线性离子阱（Q-Trap）、四极杆-飞行时间（Q-TOF）、四极杆-静电场轨道阱（Q-Orbitrap）、傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）等高分辨质谱具有全扫描、高通量、非靶向的分析特点，极大地提高了化合物的定性分析能力，在药物代谢产物分析和鉴定中的应用越来越广泛。

液质联用技术在药物代谢中的应用体现在两个方面，分别为药物代谢产物LC-MS数据采集方法和药物代谢产物数据处理方法。针对复杂的生物样本，对于可预测或已知生物转化反应的代谢产物，可采用中性丢失、前体离子和多反应监测（MRM）等扫描方式，或利用提取离子流图（EIC）方法等，靶向分析代谢产物。但由于大量内源性成分的干扰及目标成分含量低，上述代谢产物鉴定策略存在较大的局限性。随着相关仪器及软件的更新，针对此问题已有较多的解决方案，如代谢物预测软件、质量亏损过滤（MDF）、非靶标代谢组学等不同的方法，且均有其各自的特点和适用范围。

（1）基于代谢产物预测软件鉴定代谢产物　目前应用的代谢产物预测软件版本较多。代谢产物预测软件基于化合物在生物体内的转化规则，通过输入原型化合物分子式或结构式，预测可能的代谢物信息（包括可能的代谢路径、代谢产物分子式、结构式、分子质量等），构建代谢产物前体离子列表，并结合靶向的二级质谱数据，推测代谢产物信息。

例如，布鲁克·道尔顿公司研发的Metabolite ToolsTM分析平台，包括Metabolite Predict（代谢产物预测）和Metabolite Detect（代谢产物检测）两部分功能。已知原型结构式时，Metabolite ToolsTM可以预测筛查可能的副产物和代谢产物；若不知道原型结构或不确定可能的反应或者代谢过程时，其可以通过差异分析找到可能的反应或者代谢产物，并对其进行定性分析。

Metabolite Predict含有Metabolite Rules（代谢途径库）。此数据库基本包含了哺乳动物所有可能的代谢反应，可以根据药物中原型成分的结构特征及其在体内可能发生的代谢变化，选择相应的代谢途径，由此Metabolite Predict则会预测出庞大的代谢产物Masslist。

Metabolite Detect可根据样品图谱及空白图谱之间各色谱峰的差异，生成两者的差异图谱。差异图谱中即为扣除空白样品中机制背景干扰的代谢产物色谱峰。再将Metabolite Predict生成的Masslist导入Metabolite Detect中，与差异图谱进行匹配，通过差异分析并结合MDF技术寻找到可能的代谢产物并对其进行定性。

（2）质量亏损过滤方法　质量亏损过滤（MDF）技术是一种用于代谢数据处理的技术。它能将LC-MS采集的高分辨数据和预先设定的代谢产物的质量亏损数据通过软件处理来推测目标代谢物。MDF能在液质联用数据的基础上有效地获取代谢产物信息，扣除复杂生物样品的基质背景干扰。此技术在国内外广泛应用于药物代谢的研究中。

MDF指化合物或某一元素的精确质量数与其最接近的整数值之间的差异。有研究表明，代谢产物与其原型药物的精确质量数小数部分变化范围不大，可以根据原型药物精确质量数来预测代谢产物的质量亏损范围。MDF即根据母体药物与核心亚结构的质量亏损，选定MDF模板分子及设定MDF过滤窗口，在MS全扫描数据中集中提取代谢产物离子，剔除大量非目标化学成分的MS信号，保留相关成分及代谢产物的数据集，从而在复杂生物基质中快速挖掘出可能的代谢产物，以达到净化谱图和筛选、鉴定目标成分的目的。另外，通过基于背景减法的MDF，即与基峰色谱图对比搜寻外源性成分，能够对痕量成分进行识别和筛选。此方法可以大大降低背景的干扰，省时、高效，但不宜用于母体结构发生改变的代谢产物的鉴别。

MDF技术可以通过设定质量亏损范围，从复杂背景中筛选出代谢物或中药结构类似物，操作简便。随着多种优化技术的出现，将MDF技术与提取离子流图（EIC）、特征子离子过滤分析（PIF）、中性丢失过滤（NLF）、同位素过滤（IPF）、诊断碎片离子（DFI）等数据挖掘技术整合，串联或并联使用，可增加复杂生物基质样品中微量代谢物检测的灵敏度和选择性。

（3）非靶标代谢组学在代谢产物分析中的应用　非靶标代谢组学是代谢组学研究中常用的方法。区别于靶标代谢组学，非靶标代谢组学是通过高通量、无差别模式，从全局分析的角度将样本中所有的代谢物识别出来，全面寻找有差异的代谢物，用于筛选疾病的生物标志物。多元统计分析软件 SIMCA-P 常用于非靶标代谢组学中的数据分析。

非靶标代谢组学基于化学模式识别方法，主要有无监督的主成分分析（PCA）、有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。其中，PCA 能够反映组间离散程度。而PLS-DA在加入分组信息后，可减少或消除组内差异，强化组间差异。利用OPLS-DA方法能够有效筛选组间差异成分，以S-Plots图中的变量投影重要性指标（VIP）作为衡量差异成分的标准（一般VIP值＞1），再筛选对照组样本中没有，而实验组中含量较高的离子即为潜在的中药入血原型及其代谢产物。结合中性丢失、特征碎片与质量亏损过滤等数据处理方法，可快速、准确地鉴定中药代谢产物。由于中药成分及其代谢产物的复杂性，多种方式结合的代谢产物鉴定策略可极大地提高鉴定效率及准确率。