一、药物吸收的研究方法
口服用药是中药、民族药治疗的主要手段。吸收是药物进入体内的首要环节，是影响药效的关键，对其的研究可以为药物分布、代谢和排泄研究奠定基础。现代研究证实，药物口服后透过胃肠道上皮细胞进入血流，随体循环系统分布到各组织器官或靶点，并在达到一定的血药浓度时才能发挥疗效，因此口服给药的胃肠道吸收是药物产生疗效的重要前提。基于此，药学学者提出“只有吸收入血的成分才可能是药效成分”，因此吸收机制研究对揭开中药民族药体内过程这一“黑箱”至关重要。影响药物吸收的因素主要有药物的溶解性、渗透性、化学结构、肠内酶及其细胞对药物的代谢和屏障作用等。运用现代药物分析方法研究口服药物的吸收情况，可以获得吸收机制、有效吸收部位、吸收动力学、影响吸收的因素等信息。尤其对于口服生物利用度较低的药物，研究影响其吸收的因素对于改善药物的吸收性质、提高药物的临床疗效具有重要的意义。
小肠因其黏膜表面具有褶皱结构和小肠绒毛使其具有较大的表面积，同时小肠绒毛中有丰富的毛细血管和毛细淋巴管，因此是药物吸收的主要部位，也是药物转运的特异性部位。所以研究药物在肠道吸收的特征具有重要意义。目前，药物口服吸收的研究方法种类很多，主要有体外法、在体法和体内法，其有各自特点和适用范围。其中体外法是分离动物肠黏膜/肠段，或选择细胞模型进行肠吸收研究。该方法脱离整体动物、操作简单、实验周期短，可用于药物早期高通量筛选和对肠道吸收机制的研究。在体法是在整体动物基础上既保证了血液、淋巴液的供应及肠道神经、内分泌状态的完好，又可降低内容物的干扰因素，具有与体内条件接近、实验设备简单、与人体吸收指标相关性好等优点，但也存在实验动物个体差异较大的问题。体内法是以整体动物为研究对象，由于综合影响因素较大，不适用于研究药物的吸收机制，主要用于研究机体整体对药物的综合作用结果。值得注意的是，上述方法并不是替代与被替代的关系，应利用其各自优势取长补短，相辅相成，不断完善对口服制剂肠吸收特性的评价。
1.Caco-2细胞模型法 Caco-2细胞模型法最初由Hidalgo等在1989年提出。Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞，其可在培养条件下形成极性单细胞层，具有微绒毛，以及紧密连接等类似于人体小肠上皮细胞刷状缘侧的分化特征。药物透过单细胞层的体外过程与口服药物在肠道的吸收过程有良好的相关性，因而Caco-2细胞模型被广泛用于研究。在新药开发的早期阶段，Caco-2模型为目前国内外公认的研究药物肠吸收的较理想的体外模型。其主要有以下几方面优点：①同时测定药物摄取和跨膜转运；②Caco-2细胞内具有药物代谢酶，可以在代谢状况下测定药物的跨膜转运；③同源性好，生命力强，可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别，判断药物吸收的方式，求出药物吸收的动力学参数。但是Caco-2细胞模型也有一定的缺点，如缺少肠壁的黏液层，缺少细胞异质性，缺少部分代谢酶，屏障特性与小肠上皮细胞有一定差异等。
Caco-2细胞模型能够在细胞水平提供关于药物分子通过小肠黏膜的吸收、代谢、转运的信息，较之以往的体外及在体肠吸收模型更适合药物吸收进入黏膜细胞的研究。同时，它提供了关于治疗药物可能引起的黏膜毒性的信息，以及药物结构转运方面的信息。中药成分复杂多样，其中绝大多数成分需肠道吸收后才能产生药效，直接加入体外细胞培养体系中易受到中药中“杂质”（非吸收成分）等因素的影响，而此细胞模型又具有体外过程与（体内）口服药物在肠道吸收良好相关性的特点，因此以Caco-2细胞模型作为体外药效研究的“药筛”，通过“药筛”将中药中大量不能被吸收的杂质成分在进行体外实验前先行“筛”去，可增加体外实验与体内实验的相关性。
本课题组应用Caco-2细胞模型研究了白及、头花蓼等多种苗药的双向转运情况，通过考察时间、药物浓度及抑制剂等影响因素，计算其表观渗透系数，研究药物的吸收机制。
2.外翻肠囊模型法 外翻肠囊模型法由Wilson和Wiseman于1954年创建，最早用于研究葡萄糖和氨基酸在肠道的代谢与转运，后经过改进，目前成为较为常用的体外肠吸收生物模型，是一种能够快速反映药物吸收行为的体外方法。其具体操作方法：将禁食过夜的大鼠麻醉，置于37℃水浴锅上保持恒温。取出实验所需肠段，一端注入生理盐水，快速排空肠内容物，用玻璃棒快速翻转，黏膜侧朝外，浆膜侧朝内。一端结扎，另一端接取样装置，制成肠囊，注入一定体积营养液于肠囊内并将肠囊置于含药营养液的麦氏浴管中，37℃孵育。通入5% CO2和95% O2，定时取样，分析测定不同时间灌注液中药物含量，来评价药物透过肠黏膜的速度和程度。
由于该模型是离体实验操作，必须保证肠细胞在实验过程中具有活性，因此实验中需要注意以下事项：①小肠取出翻转到连接装置制成肠囊的时间控制在15分钟以内；②实验时应避免污染和有毒有害因素影响肠段的正常生理环境；③灌注液和药液要与肠道正常的生理环境相似，可选用K-R液或者Tyrode液；④培养温度需与大鼠体温一致，pH值变化不宜太大，尽量避免肠黏膜ATP酶将盐溶液酸化；⑤实验中须保持通入高浓度氧气且实验时间不宜过长，一般2小时为宜；⑥相关研究表明，肠黏膜形态会随时间延长，边缘逐渐受到破坏，肠细胞逐渐失活，因此需采用乳酸脱氢酶法测定肠细胞活力，以保证实验数据的可靠性。
外翻肠囊模型的优点是操作简单，快速易行，重现性好。在肠外翻模型中测定的是药物从肠黏膜侧到浆膜侧的透过量，可直接反映药物在肠黏膜细胞层中的转运过程，吸收结果与人的吸收水平较为接近。但该模型为体外实验，无法真实模拟体内环境，不能体现肠液、胆汁、胰液等内分泌液体对药物的影响；且该方法在肠组织外翻操作时易造成形态学损伤，影响肠黏膜对药物的吸收，并受渗透压、pH等环境因素的影响较大。虽然存在上述缺点和局限性，但该模型依旧是快速评价药物吸收机制的一种常用方法。
本课题组采用大鼠在体循环肠灌流、肠外翻模型，研究了羊耳菊中东莨菪苷等9种成分的肠道吸收特征，表明羊耳菊中9种成分在小肠均有吸收，但各成分的吸收速率、最佳吸收部位及吸收机制不尽相同，提示小肠对羊耳菊提取物中各成分的吸收具有选择性。
3.在体单向肠灌流模型法 在体单向肠灌流技术最初是由Curran和Solomon于1957年研究在体肠道吸收时创立的，该模型的优点是不仅操作简便，而且是在不切断血管和神经的条件下进行，既保证了肠道神经及内分泌输入的完好无损，同时也保证了血液及淋巴液的供应，更接近体内状态，是最常用的肠吸收研究实验方法之一。
其主要操作步骤：选用禁食过夜（自由饮水）的大鼠雌雄各半，随机分组后，麻醉固定，保持体温。腹腔开口，小心分离出实验肠段，用硅胶软管插入实验肠段两端，一端与蠕动泵相连，另一端收集灌流液。用蠕动泵将药液以一定速度灌入肠腔，定期测定药液和收集的灌流液的药物浓度，计算药物的膜表观渗透系数（Papp）和吸收速率常数（Ka），以此来判断药物在不同肠段的吸收特征。实验中有以下注意事项：①在灌流之前需要矫正蠕动泵的流速，其理论值和实际值往往有差别；②大鼠麻醉时应注意麻醉剂用量，以使大鼠保持良好的麻醉状态；若中途大鼠恢复意识，应注意及时补充麻醉剂；③肠灌流时应注意大鼠肠道的摆放应尽量避免有死角出现，否则药液无法匀速流出，会影响实验结果；④实验过程中要时刻注意大鼠肠管外壁的温度和湿度，用生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面保持创口湿润，否则易干涩影响其生物活性。
该模型的优势：①操作简便，已成为美国FDA认可的研究药物吸收的模型之一，应用广泛；②保证肠道神经的完整性及体液的供应，接近动物体内的真实吸收情况；③测得的吸收速率等指标与人体的体内吸收具有一定的相关性。但该模型也存在一定缺陷：①胆汁进入十二指肠会对肠中药物成分的吸收产生影响，需将胆汁引流或胆管结扎；②灌流管路对药物成分易产生物理吸附，在实验前需对灌流管路进行饱和；③灌流液需要较高的溶解度，极性小的药物如环烯醚萜类需要加入吐温-80、CMC-Na等助溶剂，若助溶剂用量不规范易造成溶血等副反应；④肠道会对灌流液中的水分吸收、排泄，应采用重量法进行校正；⑤不易计算药物吸收率。总之，在体单向肠灌流法应用较为广泛，适用于多数药物肠道吸收的研究。
4.在体循环肠灌流模型法 在体循环肠灌流技术是Csaky和Thale于1960年首先提出的，其模型方法与单向灌流相近，都在整体动物上进行实验。本法在单向灌流法的基础上，在大鼠麻醉后，不切断胃肠道血管及神经，于实验肠段两端插入硅胶管，上端软管与蠕动泵相连，下端软管与药液相连，形成回路，使药液在肠腔内循环灌流。与单向灌流法相比，本法的不同之处在于药物灌流液是重复从小肠段灌进→流出→再灌进→再流出，直至实验结束。通常流速调节为2～5mL/min。实验中可于不同时间分段收集含药灌流液，循环2～6小时后，终止实验。该模型从灌流液中药物的剩余药量来评价药物的吸收速率和吸收量，可以从器官水平研究药物在不同浓度、pH值、胆汁及P-gp抑制剂存在的条件下在不同肠段的吸收特征。相较于单向灌流，循环灌流模型灌流时间长，灌流速度较大，对于在肠道吸收量小的药物，不容易出现负值，实验结果也相对较稳定。
在体循环肠灌流模型是研究中药吸收的一种简便快捷、准确可行的模型，其是通过测定药物经过肠段后从灌流液消失的量来评价药物的吸收速率和吸收量，现已广泛用于药物吸收的研究。此模型具有以下优点：①易通过控制或改变实验条件来观察药物在肠段中的消除过程和影响因素；②不切断血管及神经，测得的吸收速率等指标比离体法更接近机体内的真实吸收；③保证了胃肠道内容物中酶的活性及内分泌输入的完好无损，因而可提高组织存活率和增加取样点；④能避免胃内容物、消化道固有运动等的生理影响，能较真实地反映药物的肠道吸收情况；⑤既可用作药物吸收研究，亦可用作药物稳定性研究。该模型仍存在一些不足之处，如由于在体循环肠灌流实验时间过长，灌流流速较快，可能会对肠道黏膜造成损伤，从而导致药物吸收增大，降低实验的准确性。当药物溶解度较高，且渗透量相对于药物初始浓度较低时，可采用循环肠灌流模型。
许多中药有效成分不能或很少直接吸收入血，导致其生物利用度低，但也有很多有效成分的生物利用度低的问题不是因为吸收而是代谢。应用在体肠灌流模型，结合其他模型研究中药有效成分的胃肠道转运机制对理解中医药的科学内涵具有重要作用，也是中医药现代化中的一个基本科学问题。
本课题组利用在体循环肠灌流模型，采用专属性强、灵敏度高的UPLC-QTOF/MS、UPLC-MS/MS等技术手段，研究了白及、红禾麻、荭草、隔山消等苗药的肠吸收动力学，并结合病理动物模型，模拟药物吸收的特定部位受疾病状态及胆汁对主要成分的吸收的影响等，全面评价了上述苗药多成分的肠吸收特征。
5.体内法 除了体外法和在体法外，还可用体内法进行药动学研究。体内法是以整体动物为研究对象，口服给药后在不同时间点采集生物样本（如血液、尿液）分析测定其药物浓度，并以血药浓度或尿中原型药物排泄量建立药动学模型，求算达峰浓度（Cmax）、达峰时间（tmax）、药时曲线下面积（AUC）等药动学参数来评价药物吸收的速度和程度。这些药动学参数不仅反映药物的吸收特征，也是药物在体内的ADME过程的综合反映。另外，利用AUC可以计算吸收速率常数与平均吸收时间，它们可以评价药物及其制剂的吸收特征。
体内法采用整体动物进行实验，能真实地反映药物口服后的体内吸收情况，但也存在以下缺点：①综合了物理、化学、生理、剂型等众多因素的结果，不能特异性地反映肠道对药物的吸收作用，具体吸收机制不能完全阐述明确；②实验周期长、操作相对烦琐、影响因素较多、动物个体差异较大，这些都会影响实验结果的判断；③由于某些疾病可能影响肠道的吸收和代谢，故应慎重考虑是选择病理模型还是正常动物模型进行吸收研究。鉴于上述原因，体内法较少应用于药物吸收机制的研究，一般用于研究药物体内药动学特征。
肠吸收模型对于阐明药物在体内的吸收机制和药动学有积极的作用，也可为研发新药、新剂型选择提供理论依据和指导。研究药物吸收机制的方法有很多，目前没有哪种模型的方法适合所有药物。对于不同模型，需要研究者充分了解各模型存在的优缺点，综合考虑体外、在体和体内几种方法的模型，合理选择，才有助于提高工作效率，获取最具参考价值的实验数据，也才能更客观、准确地反映药物在体内的吸收情况。