第二节 血红蛋白的测定
1.原理 血红蛋白（除硫化血红蛋白外）中的亚铁离子（Fe2+）被高铁氰化钾氧化成高铁离子（Fe3+），血红蛋白转化成高铁血红蛋白。高铁血红蛋白与氰离子（CN-）结合，生成稳定的氰化高铁血红蛋白（HiCN）。氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有一个较宽的吸收峰，它在540nm处的吸光度同它在溶液中的浓度成正比。常规测定可从HiCN参考液制作的标准曲线上读取结果。
2.HiCN试剂
氰化钾（KCN） 0.050g
高铁氰化钾[K3Fe（CN）6] 0.200g
无水磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.140g
非离子表面活性剂[Triton X-100，Saponic218等] 0.5～1.0mL
上述成分分别溶于蒸馏水中，混合，再加蒸馏水至1000mL，混匀。试剂为淡黄色透明溶液，pH为7.0～7.4。血红蛋白应在5分钟内完全转化为高铁血红蛋白。
3.操作
（1）标准曲线制备：将市售氰化高铁血红蛋白参考液稀释为4种浓度（200g/L，100g/L，50g/L，25g/L），然后以HiCN试剂调零，分别测定各自在540nm处的吸光度。以血红蛋白浓度（g/L）为横坐标，其对应的吸光度为纵坐标，在坐标纸上描点，绘制标准曲线。
（2）常规检测血红蛋白：先将20μL血用5.0mLHiCN试剂稀释，混匀，静置5分钟后，测定待检标本在540nm下的吸光度，查标准曲线求得血红蛋白含量。
4.注意事项
（1）血红蛋白测定方法很多，但无论采用何种方法，都必须溯源至HiCN的结果。
（2）试剂应贮存在棕色硼硅有塞玻璃瓶中，不能贮存于塑料瓶中，否则会使CN-丢失，造成测定结果偏低。
（3）试剂应置于4～10℃保存，不能放在0℃以下保存，因为结冰可引起试剂失效。
（4）试剂应保持新鲜，至少1个月配制一次。
（5）氰化钾是剧毒品，配试剂时要严格按剧毒品管理程序操作。
（6）高脂血症或标本中存在大量脂质可产生浑浊，引起血红蛋白假性升高。白细胞计数＞20×109/L、血小板计数＞700×109/L及异常球蛋白增高也可出现浑浊，均可使血红蛋白假性升高。煤气中毒或大量吸烟引起血液内碳氧血红蛋白增多，也可使测定值增高。若因白细胞数过多引起的浑浊，可离心后取上清液比色；若因球蛋白异常增高（如肝硬化患者）引起的浑浊，可向比色液中加入少许固体氯化钠（约0.25g）或碳酸钾（约0.1g），混匀后可使溶液澄清。
（7）测定后的HiCN比色液不能与酸性溶液混合（目前大都用流动比色，共用1个废液瓶，尤须注意），因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氢氰酸气体。
（8）为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中处理：①首先以水稀释废液（1:1），再按每升上述稀释废液加次氯酸钠（安替福民）35mL，充分混匀后敞开容器口放置15小时以上，使CN-氧化成CO2和N2挥发，或水解成
，再排入下水道。②如果没有安替福民，可用84消毒液40mL代替，除毒效果基本相同。③碱性硫酸亚铁除毒：硫酸亚铁和氰化钾在碱性溶液中反应，生成无毒的亚铁氰化钾，取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）50g，氢氧化钠50g，加水至1000mL，搅匀制成悬液。每升HiCN废液，加上述碱性硫酸亚铁悬液40mL，不时搅匀，放置3小时后排入下水道。但除毒效果不如前两种方法好。
（9）HiCN参考液的纯度检查：①波长450～750nm的吸收光谱曲线形态应符合文献所述，即峰值在540nm，谷值在504nm。②A540nm/A504nm的吸光度比值应为1.59～1.63。③用HiCN试剂作空白，波长710～800nm处，比色杯光径为1.000cm时，吸光度应小于0.002。
由于HiCN试剂所含剧毒的氰化钾会污染环境，对环境保护不利。为此，各国均相继研发不含氰化钾的测定血红蛋白方法，如SLS-Hb现已应用于血细胞分析仪上，但其标准应溯源到HiCN量值。
1.原理 除硫化血红蛋白外，血液中各种血红蛋白均可与十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulfate，SLS）作用，生成十二烷基硫酸钠血红蛋白（SLS-Hb）棕色化合物，SLS-Hb波峰在538nm，波谷在500nm。本法可用HiCN法标定的新鲜血，再制备本法的标准曲线。
2.试剂
（1）60g/L十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液：称取60g十二烷基硫酸钠溶解于33.3mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）中，加TritonX-100 70mL于溶液中混匀，再加磷酸盐缓冲液至1000mL，混匀。
（2）SLS应用液：将上述60g/LSLS原液用蒸馏水稀释100倍，SLS最终浓度为2.08mmol/L。
3.操作
（1）准确吸取SLS应用液：5.0mL置于试管中，加入待测血20μL，充分混匀。5分钟后置540nm下以蒸馏水调零，读取待测管吸光度，查标准曲线即得SLS-Hb结果。
（2）标准曲线绘制：取不同浓度血红蛋白的全血标本，分别用HiCN法定值。再以这批已定值的全血标本，用SLS-Hb测定，获得相应的吸光度，绘制出标准曲线。
4.参考区间
成人：男131～172g/L；
女113～151g/L；
新生儿：180～190g/L；
婴儿：110～120g/L；
儿童：120～140g/L。
5.注意事项
（1）注意选用化学纯（CP）级以上的优质十二烷基硫酸钠[CH3（CH2）3SO4Na，MW 288.38]。本法配方溶血力很强，因此不能用同一管测定液同时测定血红蛋白和进行白细胞计数。
（2）如无TritonX-100可用国产乳化剂OP或其他非离子表面活性剂替代。
（3）其他环保的血红蛋白测定方法还有很多，如间羟血红蛋白等。
6.临床意义
（1）生理性增加：主要见于新生儿、主要见于高原地区居住者。
（2）生理性减少：主要见于婴幼儿、老年人及妊娠中晚期等。
（3）病理性增加：主要见于真性红细胞增多症、代偿性红细胞增多症，如青紫型先天性心脏病、慢性肺部疾病、脱水。
（4）病理性减少：主要见于各种贫血、白血病、产后、手术后、大量失血。
在各种贫血时，由于红细胞内血红蛋白含量不同，红细胞和血红蛋白减少程度可不一致。血红蛋白测定可以用于了解贫血的程度。如需要了解贫血的类型，还需做红细胞计数和红细胞形态学检查及红细胞其他相关的指标测定。