一、疫苗种类

（一）减毒活疫苗

减毒活疫苗（attenuated live vaccine）是通过多种方法使病原体（细菌、立克次体或病毒）毒力减弱，保留了病原体在体内生长繁殖的能力，具有免疫原性，可以引发机体产生特异性的免疫应答，但不会引发机体出现类似野株感染后的临床表现。 减毒的方法包括体内、体外培养法、温度筛选法、空斑挑选法、基因重配法、终末稀释法、诱变法、基因缺失及反向遗传等，随着科学技术的迅猛发展，越来越多的新技术已用于细菌或病毒等病原体的减毒，以制备减毒活疫苗。

减毒活疫苗可以模拟自然感染途径给药，很少需要佐剂。 减毒活疫苗可以刺激机体产生很强的免疫反应，并且维持长时间的免疫保护。 但对于免疫缺陷患者，减毒活疫苗有可能无法刺激机体产生足够的保护力。 同时，由于活的病原体仍具有突变的能力，因此对其进行突变的检测是质量控制的重要环节。 此外，减毒活疫苗是最不稳定的一类疫苗，通常需要冷链运输和保存。

细菌类减毒活疫苗（如卡介苗、鼠疫疫苗、炭疽疫苗和布氏菌疫苗等）的生产包括菌体培养、菌体收集和洗涤、菌体研磨、定量稀释等。 细菌类减毒活疫苗按其生产工艺的特性，一般属于非最终灭菌产品。 目前，细菌类减毒活疫苗最具代表的是皮内注射用卡介苗，另外包括皮上划痕鼠疫活疫苗、皮上划痕人用炭疽活疫苗和皮上划痕人用布氏菌活疫苗等。 以卡介苗为例，生产主要包括表面浮膜培养和深层培养两种方法。 前者是将菌种在敏感培养基上培养，收集液体表面形成的菌膜，研磨后加入稳定剂，分装冻干而成。 深层培养是指将菌种表面増菌培养后，在液体培养基中深层培养，收集菌体，加入保护液制备而成。

病毒类减毒活疫苗包括麻疹减毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、乙脑减毒活疫苗、脊髓灰质炎减毒活疫苗等。 病毒类减毒活疫苗的生产工艺通常包括细胞制备、病毒接种和培养、病毒收获、合并/浓缩、半成品配制、成品制备等过程。 不同的病毒类减毒活疫苗基于自身毒种及培养基质等原因的特殊性，在不同操作阶段会有一些区别。 比如有的疫苗制品需要进行细胞破碎、释放病毒才能进行病毒收获，有的还需要进行病毒抽提等。

用于病毒类疫苗生产的细胞基质（cell matrix）包括原代细胞、二倍体细胞和连续传代细胞。 原代细胞是对动物组织进行机械剪切，胰蛋白酶消化等方法获得。 二倍体细胞和连续传代细胞可以直接进行培养。 用生物反应器培养将细胞培养为单层后，加入病毒工作种子进行培养，待细胞病变达到要求时收获病毒原液。 原液制备是病毒类减毒活疫苗生产的一个关键步骤，在病毒收获之后，病毒类减毒活疫苗原液生产工艺一般是将检定合格的同一细胞批生产的多个单次病毒收获物进行合并，即成为原液。 根据各疫苗产品生产的特殊性，部分疫苗产品在进行合并时有一些特殊要求，如有的在合并时需要澄清过滤、有的是将收集后的病毒上清液进行合并、有的还需要进行适当浓缩。

原液作为病毒类减毒活疫苗的重要中间产品需进行充分的检定。 各疫苗需要按照《中华人民共和国药典（2020年版）》各论或注册批准的制造检定规程的要求对原液进行取样及检定。 将检定合格的病毒原液合并，加入稳定剂后制备为半成品，通过分包装或冻干制备为减毒活疫苗成品。

（二）灭活疫苗

灭活疫苗（inactivated vaccine）和减毒疫苗一样，也含有全病原体。 灭活疫苗是通过物理或化学方法，将病原体灭活，破坏病原体的繁殖能力和致病力。 病原体灭活后仍然具有大量的表面抗原，可以引起免疫反应。 灭活疫苗的优点是表面抗原一般都很稳定，并且保留了高比例的病原体抗原，同时灭活的病原体不能恢复或变异为更具毒性的形式来引起疾病。 然而，灭活疫苗无法在宿主体内复制，其免疫反应强度不如减毒活疫苗，提供的保护时间较短，通常需要加大剂量、增强免疫和/或添加佐剂来达到良好的免疫学反应和持久保护。

该类疫苗的生产工艺较为复杂，包括细胞培养、病毒接种、病毒培养、病毒收获、病毒浓缩、病毒灭活、病毒纯化、半成品配制、分装、压塞、轧盖、包装、贮藏和运输等步骤，其主要环节如下。

1.病毒浓缩

同一细胞批生产的病毒收获液经检验合格的可进行合并。 合并的病毒液，按照一定的浓缩倍数或其他要求，经超滤、离心或其他适宜的方法浓缩至一定体积。 病毒浓缩前，可采用微滤、离心或其他适宜的方式澄清病毒收获物，去除细胞碎片等杂质。 浓缩病毒液需要贮存的，应按照批准的要求置于适宜的条件下贮存。

2.病毒灭活

不同疫苗可在不同工艺阶段进行病毒灭活。 例如，可在病毒收获后、浓缩前灭活，也可在病毒浓缩后、纯化前灭活，有的疫苗在病毒纯化后或纯化过程中进行灭活。常用的灭活方法是加入灭活剂，包括甲醛、β-丙内酯等。

病毒液应在规定的蛋白含量、滴度、抗原含量或其他适宜的指标范围内进行病毒灭活。病毒液加入一定浓度的灭活剂，置适宜温度下孵育一定时间进行病毒灭活。 病毒灭活程序结束后，每个灭活容器均应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。 病毒灭活验证试验应选择敏感的病毒检测方法，通常采用将已灭活的病毒液接种至敏感细胞或组织盲传数代的方法。

有些疫苗在病毒灭活过程中有特殊要求，例如，有的疫苗需要在灭活期间除菌过滤并在灭活过程中取样进行病毒灭活验证；用β-丙内酯灭活的疫苗，在灭活完成后还需在适宜温度下放置一定时间，以确保β-丙内酯完全水解。

3.病毒纯化

不同类型疫苗的纯化工艺技术及目的要求不尽相同，不同纯化工艺过程控制有差别，对于二倍体细胞培养的病毒疫苗主要是去除培养基成分（尤其是血清成分）、灭活剂等杂质；对于鸡胚培养的病毒疫苗主要是去除灭活剂、内毒素等成分；对于原代细胞、连续传代细胞培养的病毒疫苗主要是去除宿主细胞成分、培养基成分（尤其是血清成分）以及灭活剂等杂质。

病毒类灭活疫苗的纯化工艺通常将数种不同原理的纯化方法相结合，从而达到既获得较高的病毒回收率，又达到较高杂质去除率的目的。 纯化方法包括梯度离心法、层析法。

4.佐剂吸附

纯化后的抗原通常吸附佐剂，以增强其免疫效果，常用的佐剂为氢氧化铝，还有一些新型佐剂正在研究中，如凝胶型佐剂、微生物佐剂、微粒型佐剂、乳剂和合成佐剂等。

（三）亚单位疫苗

亚单位疫苗（subunitvaccine）是选取细菌、病毒中具有免疫原性的成分制备成的疫苗，其有效单位主要是病毒外膜蛋白、细菌多糖、细菌外膜蛋白、细菌外毒素等。 亚单位疫苗主要包括细菌类毒素、病毒蛋白、基因工程重组疫苗等。

1.类毒素（toxoid）

是通过物理或化学的方法，使细菌外毒素失去毒性而保持原有的免疫原性和抗原性的一类蛋白质。 常用的脱毒处理方法为甲醛脱毒法和戊二醛脱毒法。 由于类毒素的免疫原性高，可作为疫苗的有效组分用于预防相关传染病。 1923年Ramon 使用甲醛及热处理破伤风外毒素，得到了具有抗原性的破伤风类毒素，并取得很好的免疫效果。1926年，Ramon 等分别使用破伤风类毒素和白喉类毒素成功地给人进行了免疫，对于预防破伤风和白喉的发生起到了决定性的作用。 现在全球范围内常用的类毒素包括百日咳类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素等，主要是制备以百日咳、白喉、破伤风为基础的联合疫苗。

由于类毒素本身分子量较大，在脱毒过程中容易产生聚合体，使过敏原性增强，且在脱毒后可能发生毒性逆转，因此国际上不断在研发新型类毒素疫苗。 CRM197（cross reacting material 197）是白喉毒素的突变体，它的第52 位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，从而不能对细胞产生毒性作用，但在抗原性和免疫原性上仍与天然的白喉毒素保持一致，从而避免了脱毒过程中毒性逆转发生的可能，可作为载体蛋白和疫苗的候选组分广泛用于疫苗研发，是类毒素发展的新方向之一。 2010年，以CRM197 为蛋白载体的13 价肺炎球菌结合疫苗已获得美国食品药品管理局（FDA）批准。

此外，由于类毒素分子量较大，抗原性强，致敏性也强，可以采用生物化学的方法提取纯化有效的特异性抗原制成亚单位疫苗。 破伤风毒素含有A、B、C 3 个片段，其中C 片段分子量是破伤风毒素分子量的1/3，本身没有毒性，但是具有很强的免疫原性，过敏原性也很低，可以用于人群免疫，预防破伤风的发生，是亚单位疫苗的理想候选者。

2.病毒亚单位疫苗

亚单位疫苗仅包含病原体中的部分关键抗原。 如乙型肝炎病毒（简称乙肝病毒）亚单位疫苗仅包含乙肝病毒表面抗原，流感病毒亚单位疫苗包含血凝素和神经氨酸酶两种抗原。 这些疫苗可刺激免疫系统产生特异性免疫保护反应，所诱导的免疫反应更具靶向性，降低了与免疫接种相关的不良反应（如发热和不适等）。 该类疫苗的研制需要首先对免疫系统在抗感染过程中识别和反应机制充分了解，明确病原体的哪类成分可以诱导机体产生保护性免疫反应。

亚单位疫苗可通过化学分解或蛋白水解的方法，裂解病原体后，筛选纯化目的抗原制备而成。 例如流感病毒亚单位疫苗是将病毒液过滤、收集、浓缩后，通过蔗糖密度梯度离心进行纯化，然后在适当的裂解剂和裂解条件下，将流感病毒的表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶分别裂解下来。 病毒裂解剂主要为表面活性剂，可以破坏细胞膜，如乙醚、牛磺脱氧胆酸钠、甲醛、脱氧胆酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚山梨酯80 等。 用适当的方法进行病毒灭活后，通过超滤去除裂解灭活剂和前序工艺中加入的蔗糖，然后经区带密度梯度离心纯化目标蛋白，最后收集纯化得到血凝素和神经氨酸酶蛋白；然后再用超滤浓缩和透析法去除目标蛋白中的杂质，最后除菌过滤得到流感亚单位单价疫苗。

3.重组蛋白疫苗（recombinant protein vaccine）

是采用DNA 重组技术生产的疫苗。这类疫苗的成功制备首先需要确定目标病原体中能够刺激免疫应答的蛋白抗原，然后将编码这些蛋白的遗传物质插入表达载体中，构建含有目标蛋白基因的表达载体，将该表达载体导入宿主细胞，筛选含有表达载体的工程细胞建立种子库，对种子库复苏后规模化培养，使目标蛋白充分表达，然后收集表达的目标蛋白进行多步骤纯化，获得纯化蛋白后吸附佐剂制成疫苗。 常用的表达系统有酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和大肠杆菌。 研制这类疫苗成功的关键是产生保护性免疫反应的抗原明确，而且这类抗原表达后的修饰和组装要与天然抗原类似。 有些抗原需要保持构象性结构，如基因工程重组乙型肝炎疫苗、戊型肝炎病毒疫苗和人乳头瘤病毒疫苗等的抗原都形成了类病毒颗粒，保持了天然构象，能够诱导很好的免疫反应。

除了病毒抗原采用基因工程技术进行表达以外，细菌类抗原也开始采用基因工程技术进行表达。 如类毒素的性质相对稳定，但是脱毒过程会导致免疫原性降低，还存在毒性逆转的风险。 通过采用现代基因工程技术，构建表达细菌外毒素编码基因的表达载体，制备重组的、无毒性的毒素蛋白或毒素蛋白片段，用于疫苗生产。 现在，大肠杆菌表达的重组霍乱毒素B 亚单位疫苗已经在我国上市。

（四）联合疫苗

联合疫苗（combined vaccine）是用于预防由不同种类病原体引起的多种感染性疾病或同种、不同血清型病原体引起的单一感染性疾病的疫苗。 美国FDA 对联合疫苗的定义是指能够预防多种疾病的联合制品（其中包括在注射前混合的制品和载体疫苗）；或能预防由同一病原体的不同株或不同血清型引起的同一疾病的多价疫苗。 这类产品可以由活的或灭活的多种微生物以及多种纯抗原联合制成。 如果疫苗所用载体也可预防此载体所引起的疾病，亦认为是联合疫苗。 世界卫生组织关于联合疫苗的定义是指含有两个或多个活的生物体、灭活的生物体或提纯的抗原，由生产者联合在一起或注射前即时混合，用于预防多种疾病或预防由同一生物体的不同种或不同血清型引起的一种疾病。 如果将载体疫苗和偶联疫苗的载体菌或偶联的载体成分所引起的疾病也作为其适应证时，则载体疫苗和偶联疫苗也属于联合疫苗。

联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗两种形式。 多联疫苗是将不同病原体抗原混合制成的疫苗，可预防几种不同疾病，如百白破联合疫苗，可预防百日咳、白喉和破伤风3 种疾病；麻腮风联合减毒活疫苗，可预防麻疹、风疹和腮腺炎3 种疾病。 多价疫苗则是将同种病原体的不同血清型或基因型混合制成的疫苗，只预防一种疾病，如脊髓灰质炎灭活疫苗是可以同时预防1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒的三价疫苗，9 价人乳头瘤病毒疫苗可以同时预防9个型别的HPV。

随着医学和生物学技术的发展，全世界的研究者不断地进行新疫苗的研究开发，联合疫苗已经成为疫苗发展的新趋势。 以百白破为基础的联合疫苗已经从百白破三联疫苗发展到了DTaP-IPV 四联疫苗、DTaP-IPV-Hib 五联疫苗、DTaP-IPV-Hib-HepB 六联疫苗，还有DTaPHib-A/C、Tdap-IPV 等多种联合疫苗正在研发阶段。 欧美等主要发达国家已经将联合疫苗纳入扩大免疫规划（expanded program immunization，EPI）程序中。

联合疫苗的优点主要包括以下4 点。

1.减少接种次数，节省受种者及家属的时间和精力，提高受种者依从性。

2.减少疫苗不良反应的概率。

3.降低预防接种服务提供方的接种成本和管理成本，提高卫生资源效率。

4.提高疫苗的接种率和补种率。

根据多联疫苗的抗原构成，可以将其大致分为以下4 类。

1.以百白破联合疫苗为基础的多联疫苗，如我国现在使用比较广泛的DTaP-IPV-Hib 五联疫苗，含有百日咳、白喉、破伤风、灭活脊髓灰质炎（三价）、b型流感嗜血杆菌结合疫苗5种组分。

2.以麻疹疫苗为基础的多联疫苗，如麻腮风水痘联合疫苗。

3.以甲型肝炎病毒（简称甲肝）、乙肝疫苗为基础的多联疫苗。

4.其他多联疫苗，如A/C-Hib 联合疫苗。

从当前已经上市的疫苗来看，以百白破联合疫苗为基础的多联疫苗占全部多联疫苗的绝大多数，是研制多联疫苗的最重要基础。

联合疫苗并不是将多种疫苗成分进行简单混合，其研发需要考虑到所含各个单价疫苗中抗原间的相容性、多组分的安全性、非疫苗组分的相互作用、佐剂的选择、疫苗稳定性等因素。

联合疫苗中由于抗原成分比单价疫苗复杂，抗原含量高，其安全性评估非常重要。 大量的研究证明，基于DTaP 的多联疫苗的不良反应率多以一般性反应为主，主要包括轻度或中度发热、嗜睡、食欲下降等全身症状，以及发红、肿痛等局部症状，并且多联疫苗接种组的不良反应率与对照组（分别接种DTaP 和其他相应疫苗）相比，无统计学差异。

（五）结合疫苗

目前用于儿童预防接种的结合疫苗主要包括b型流感嗜血杆菌结合疫苗、A 群C 群脑膜炎球菌多糖结合疫苗和13 价肺炎球菌结合疫苗等。 结合疫苗也是目前多联多价疫苗的主要组成部分。 例如DTP-Hib 四联疫苗、DTP-Hib-IPV 五联疫苗和AC 脑膜炎球菌-Hib 三联疫苗等。

结合疫苗（conjugate vaccine）是在传统细菌组分疫苗——细菌多糖疫苗基础上，采用化学方法将多糖抗原分子与适宜的蛋白质结合制备而成。 多糖抗原是胸腺（T 细胞）非依赖性抗原，在免疫系统发育尚不完全的婴幼儿中不能产生有效的免疫应答，即无免疫原性或免疫原性较差。 而多糖抗原与蛋白结合后转变成了胸腺（T 细胞）依赖性抗原，不仅可以在2 岁以下婴幼儿诱导出达到免疫保护水平的特异性抗体，而且具有免疫记忆效应。 因此结合疫苗具有比传统多糖疫苗更好的免疫保护作用。 通常将与多糖抗原共价结合的蛋白质称为载体蛋白。 常见的蛋白载体包括破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（DT）、白喉无毒突变株的CRM197 蛋白、B 群脑膜炎球菌的外膜蛋白（MenB-OMP）等。 目前认为不同载体的多糖-蛋白结合物的免疫原性由强到弱依次为MenB-OMP、TT、CRM197 和DT。

结合疫苗的生产工艺包括以下三大部分。

1.多糖抗原的制备和纯化

多糖抗原的制备和纯化的生产工艺与多糖疫苗相同。

2.蛋白载体的制备

载体蛋白破伤风类毒素和白喉类毒素的生产工艺与组分疫苗中的类毒素疫苗基本一致，但在与多糖抗原结合前必须经过进一步纯化处理。

3.多糖-蛋白结合物的制备

有两种生产工艺。

（1）溴化氰活化法：

该结合工艺是在碱性条件下采用溴化氰活化多糖分子中的羟基形成氰酸脂，然后与己二酰肼反应，将己酰肼基团导入多糖分子形成多糖衍生物，最后在介导物碳二亚胺的介导下与蛋白载体结合形成稳定的结合物。

（2）还原氨化法：

该结合工艺的原理是糖类在水溶液中大多以环状半缩醛形式存在，而醛和酮很容易与蛋白中的氨基反应形成西夫碱，所形成的西夫碱在还原剂，例如氰硼氢化钠的作用下还原成稳定的多糖蛋白结合物。