三、热凝胶聚合物的类型

（一）天然热凝胶聚合物

1.纤维素

纤维素是世界上最常见的有机化合物，通常从树木或棉花等植物中提取，但也可以从细菌或海洋脊索动物中分离出来。纤维素是由具有高分子内氢键的重复葡萄糖单体组成，不溶于水。然而，对单体结构的修饰可以减少这种氢键，并产生水溶性和热凝胶性的纤维素衍生物。这些热凝胶衍生物中最常见的是甲基纤维素（图7-2A），它是通过醚化反应将链上的羟基与甲氧基取代而制备的。这种反应通常分为两个步骤：首先，由于纤维素不溶解，反应后的纤维素会在碱性介质（如氢氧化钠）中膨胀。接下来，它将被醚化剂处理，如碘甲烷、氯甲烷或硫酸二甲酯，生成甲氧基取代衍生物甲基纤维素。甲基纤维素是一种天然衍生的热凝胶，具有低临界溶液温度（LCST）。其通过疏水相互作用而不是螺旋结构转换形成热凝胶。其下临界温度介于40℃和70℃之间，具体下临界温度数值取决于甲氧基取代度和在溶液中甲基纤维素的浓度。这可能是使甲基纤维素难以用于生物医学的原因之一，甲基纤维素必须与盐混合，或与疏水性更强的材料共聚，从而将下临界温度降至生理温度以下。一旦凝胶化，甲基纤维素就会形成一种细胞相容的生物降解基质，其硬度为1～10Pa。

甲基纤维素最常用于可注射凝胶体系，尤其是结合组织工程技术。最近发表的一项研究使用了一种可注射的甲基纤维素，该系统含有用于伤口愈合的银纳米颗粒。作者将甲基纤维素溶液与醋酸银盐类化合物混合，增加其脱盐效果。注射后，醋酸银分子离解成离子状态。由于其固有下临界温度低于生理温度，甲基纤维素会在原位形成凝胶。另外，银离子在原位氧化形成具有抗菌性能的氧化银纳米颗粒，能够使细菌减少99.9%。同样的研究小组也采用了类似的模型，使用磷酸钙纳米颗粒进行骨再生。

甲基纤维素还与从脂肪组织中提取的可溶性胞外基质（sECM）一起用于伤口愈合。将6%（质量百分比）的sECM融入甲基纤维素，足以把下临界温度从44℃降低至34℃，创建一个原位热凝胶聚合物。当这种混合热凝胶与脂肪干细胞一起使用时，全层皮肤伤口愈合速度加快，与单独使用混合水凝胶或对照组相比，瘢痕较少。透明质酸还可以与甲基纤维素结合并用于神经组织工程。以1∶7的比例混合透明质酸和甲基纤维素，与聚乙二醇（PEG）交联。透明质酸和甲基纤维素在体内降解较快，但由于PEG交联剂的加入而延迟了降解。透明质酸甲基纤维素（HAMC）在24.4℃发生热凝胶反应，形成直径50～70μm的气孔。但在细胞毒性研究中，HAMC凝胶轻微降低细胞存活率，但仍需要进行彻底的体内研究，以评估该系统在神经组织工程中的应用潜力。

2.壳聚糖

壳聚糖是另一种常见的多糖（图7-2B），是通过壳聚糖的去乙酰化而得到的。壳聚糖是从甲壳类动物（如螃蟹和虾）外壳中发现的一种化合物。壳聚糖溶于弱酸，在溶液pH大于6时自发形成凝胶。然而，如果用磷酸盐（如甘油磷酸酯或磷酸铵）中和，壳聚糖将在生理pH下保持溶解状态，凝胶会随温度而变化。虽然最初认为是由于甘油磷酸盐中的甘油破坏了水分子的氢键，使壳聚糖具有了这种新的热凝胶能力，但进一步的研究表明，无甘油作用下不仅可以产生凝胶，而且比基于甘油的体系更快。这种现象，再加上壳聚糖由磷酸盐交联后形成的不可逆热凝胶，可能说明了一种机制，即二价磷酸离子与壳聚糖链之间除了增加疏水相互作用外，还有电荷离子键的相互作用。

当壳聚糖被磷酸盐中和后，根据其分子量、浓度，以及去乙酰化程度，可得出其下临界温度大致为30℃。壳聚糖具有生物降解性和细胞相容性，但用于中和反应中使用的甘油磷酸盐具有潜在的细胞毒性，这引起了人们的关注。此外，壳聚糖有可用的胺基基团，由于其相对高的反应活性，便于附着各种生物分子以进一步细化水凝胶，使壳聚糖成为一种常见的多聚热凝胶。

最近的一项研究使用含细胞壳聚糖热凝胶，结合3D打印多聚聚己内酯（PCL）技术，构建人造骨骼支架。研究人员使用PCL支架解决骨髓间充质干细胞相容性问题。在37℃培养时，壳聚糖稠化，使得混合支架与PCL获得一定的强度，增加壳聚糖在细胞培养中的作用。与PCL支架相比，杂交支架上的细胞具有更高的成骨基因表达水平，包括碱性磷酸酶（ALP）和骨钙蛋白（OCN），钙沉积水平也高于PCL和壳聚糖支架。壳聚糖热凝胶还可以装载重组人骨形态发生蛋白质-2（BMP-2），并在7天内释放。

壳聚糖主体打印出来后，构建了相对坚固且具有良好溶解性的水凝胶支架。尽管打印后可以选择性地种植细胞，但由于所用的酸性交联剂和该溶剂蒸发后导致的凝胶硬度增强，使壳聚糖并不适用于含细胞打印。相较而言，壳聚糖与明胶混合，可以创造出适合细胞打印的生物墨水。壳聚糖-明胶复合材料具有良好的抗微生物活性，已被应用于皮肤工程领域。复合材料生物墨水表现出轻微的触变性，具有高临界溶解温度（UCST），明胶作为该体系中的主要成分。在优化细胞种植浓度和打印压力后，研究人员能够打印直径为450μm的水凝胶纤维。将细胞直接种植在生物墨水表面，与仅由壳聚糖组成的水凝胶相比，细胞在明胶壳聚糖混合生物墨水表面的存活率显著提升。在两年后的一项研究中，研究人员使用一种便宜的（<1 000美元）生物打印机，展示了复合生物墨水在生物3D打印中的前景。有趣的是，壳聚糖明胶生物墨水呈现出低临界溶液温度，而不是前期研究中报道的在26℃和32℃范围内形成凝胶的高临界溶解温度。由于这种低临界溶液温度，生物墨水必须在混细胞前冷却，然后打印在加热的打印平台上。由于这种预冷过程，研究人员观察发现该体系中细胞存活率低于其他生物打印系统（<75%），但实验结果仍然显示单一使用热凝胶是一种生物墨水的良好选择。

3.明胶

明胶是一种经过加工的胶原蛋白，其三重螺旋结构大部分变性为单一螺旋结构（图7-2C）。明胶是天然聚合物中最常用的热凝胶材料。早在14世纪，欧洲已经出现食用明胶，明胶相关的研究也非常深入和透彻。明胶分子结构中，含有大量的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）氨基酸序列片段，该片段可以促进细胞黏附，在细胞被明胶包裹后后具有良好的细胞活性。明胶还很容易通过一些常见的交联剂发生交联反应，也可以通过基质金属蛋白酶降解。如前所述，当明胶冷却时，其螺旋结构会发生转变，在临界温度下，形成一个螺旋状的凝胶网络。

明胶的上临界温度为24℃到34℃，具体温度取决于明胶浓度。也正是由于这个原因，明胶需要与另一个聚合物形成共聚合物，从而使得上临界温度上升至37℃，或者使得自身低临界溶液温度的热凝胶成为系统中的主要成分。由于明胶分子中的氨基酸片段对细胞增殖具有促进作用，并且明胶容易被酶降解，使得明胶成为最常用的负载细胞水凝胶材料。

明胶是一种热门的生物打印材料，因为它保留了传统3D打印墨水的特征：加热液化，冷却后凝固。该打印方法也用于打印明胶甲基丙烯酰胺支架，该生物墨水可以通过光敏交联，在温度发生变化时仍然保持其结构。结果表明，聚合物浓度和打印温度对打印结构的直径有显著影响。此外，当紫外线剂量为1 800mJ/cm²时，打印细胞的存活率>97%。研究人员能够将明胶的热凝胶性能与甲基丙烯酰胺的光敏性能相结合，构建一种生物墨水，其打印分辨率可以达到400μm，打印纤维存储模量为10kPa，打印后14天细胞存活率在97%以上。同样，明胶可以与海藻酸盐混合促进热凝胶打印，与氯化钙发生离子交联。在这两种情况下，我们都可以观察到明胶用于热凝胶打印，通过打印后交联反应，形成强度更高的打印结构。

明胶也被用作牺牲替代材料，形成负载细胞的血管化管道。通过打印一种含细胞的明胶/胶原同心圆结构，升高温度，洗脱液化明胶形成管道。被包裹的细胞会附着在周围的胶原蛋白上，形成一个含细胞的血管通道。

（二）合成热凝胶聚合物

1.聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）

PNIPAAm可能是最广为人知、应用最广泛的热凝胶聚合物（图7-2D）。自20世纪50年代首次合成后，因为加热后经历溶胶-凝胶转变，在20世纪80年代后期和90年代初引起广泛关注，特别是在生物医学领域。特别是，未改性PNIPAAm的下临界温度大约是30～35℃，该温度范围在生理温度以下，但高于环境温度，使其相当适合生物应用。

采用自由基聚合、氧化还原聚合、可逆加成-碎裂链转移（RAFT）聚合和原子转移自由基聚合（ATRP）等方法合成具有热凝胶能力的PNIPAAm。然而，PNIPAAm是不可生物降解的，因此为了使其具有生物降解性能，必须使其交联从而获得生物降解性，或者使用水解或酶解的基团对其进行改性，将其降解为亲水性组分，从而使下临界温度高于生理温度，促进聚合物的再吸收。此外，PNIPAAm凝胶可以经历一种称为“协同作用”的物理收缩，这种收缩将极大地改变支架形状，除非在其形变之前进行交联。

已经有了大量的研究报道基于PNIPAAm水凝胶的各种生物医学应用，这一节只能罗列部分内容，我们将只关注其在再生医学中的近期应用。在开发基于PNIPAAm的可注射水凝胶体系方面，已经有了大量的研究，该系统在体内可吸收，不会因与骨组织工程同时使用而导致形变。因为甲基丙烯酸甘油酯（GMA）具有一个下垂的环氧环，所以PNIPAAm可以与GMA发生共聚反应。该环氧环作为二胺交联剂聚胺（PAMAM）交联链，可防止形成凝胶。此外，丙烯酸酯（dimethyl-γ-butyrolactone，DBA）加入反应，作为聚合物分子主架。DBA含有一个可水解的内酯环，水解后可降解为亲水羟基和羧基。这种降解导致下临界温度上升至生理温度以上，使得聚合物容易被吸收。同时加入丙烯酸（acrylic acid，AA）对体系的下临界温度进行微调。实验证明，这些可注射凝胶一旦注入颅骨缺损处，可以维持间充质干细胞的存活率并促进矿化。

利用天然化学物质交联（NCL）作为交联机制，而不是环氧胺反应，开发了类似的双胶凝注射体系。NCL通过硫酯和N端半胱氨酸的转硫酯化反应，进行氮元素到硫元素的重新排列，形成稳定的肽键。尽管NCL之前已经被认为是一种具有选择和生物相容性的化学反应，但它发生速度缓慢，因此很难用于可注射系统。然而，如果在该系统中加入热凝胶，热凝胶可以用来保持注入材料的形状，为NCL交联争取反应时间。因此，半胱氨酸端基单体，N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-半胱氨酸（HPMACys）与PNIPAAm和PEGf发生共聚反应，形成PNIPAAm-co-HPMACys-PEG-PNIPAAm-HPMACys共聚物。这种共聚物在37℃形成凝胶，该凝胶和硫代酸酯修饰的聚乙二醇（PEG）或透明质酸交联时产生凝胶，该凝胶具有5kPa的储存模量，显示了作为组织工程支架的良好的机械条件。该系统也已应用于3D打印。将共聚物打印在37℃的温度平台上，水凝胶会产生良好的打印性能，交联后的打印物储存模量可达9kPa。此外，将PCL-N-羟基琥珀酰亚胺加入交联体系中，水凝胶能够通过共价接枝得到更加坚固的结构，使得打印物达到超过600kPa的储存模量。与透明质酸交联的水凝胶，细胞存活率可高于90%，也充分说明了该方法在骨科组织工程方面的潜力。

最近的另一项研究利用PNIPAAm的热凝胶特性使透明质酸更易于打印。通过将PNIPAAm嫁接到透明质酸的主干上，研究人员能够将PNIPAAm的热响应特性融入共聚物网络中。因此，水凝胶在加热的打印平台上也可以维持打印结构。然后将打印物置于紫外线下交联，凝胶内未聚合的甲基丙烯酸透明质酸在紫外线的作用下进行交联，形成热聚合透明质酸-PNIPAAm和光聚合透明质酸-甲基丙烯酸酯（HAMA）的网络。随后将温度降至4℃，透明质酸-PNIPAAm开始溶解，留下HAMA网络保持打印的凝胶纤维结构。

2.聚环氧乙烷（PEO-PPO-PEO）

即泊洛沙姆，商标名为普朗尼克^®，是一种由两个亲水的共聚物聚环氧乙烷（PEO）和两侧的疏水聚合物丙烯氧化物（PPO）组成的两亲共聚物（图7-2E）。这种A-B-A型两亲三嵌段共聚物有利于在较低温度下形成热凝胶。研究发现，泊洛沙姆F127（PF127）溶解温度较低，因此有利于生物方向的应用。在室温下（低于25℃）该水凝胶是黏性溶液，但是在体温（37℃）下则形成固体凝胶。泊洛沙姆随着温度的上升，其内部形成微型颗粒，从而形成固体凝胶。与PNIPAAm类似，这种合成的聚合物具有较低的免疫原性，但也不能生物降解，必须对其进行改性，使其更适合在生物体内使用，也更适合包裹细胞。

泊洛沙姆用于药物输送有着悠久的历史。最近，PF127与透明质酸（HA）混合，形成了一种可注射给药系统，增加了非甾体抗炎药（NSAID）局部给药的稳定性。HA上的乙酰基与PF127上的甲基相互作用，形成微颗粒间交联，可减缓凝胶的降解速度。由于降解速度减慢，药物释放时间得以延长，从而减少注射和降低高浓度释放带来的副作用。

PF127已作为一种替代材料用于打印复杂的组织结构。复合生物墨水由明胶、纤维蛋白原、透明质酸和甘油组成，并可用于打印两种不同细胞类型的复杂系统。使用PCL从水凝胶内部提供机械力支持，而PF127被用作外部支架帮助维持其打印结构形状，类似于传统3D打印中的支持结构。一旦打印完成，PF127就随着温度的升高而褪去。该方法有利于构建复杂结构。如耳朵，需要充分种植软骨细胞，以获取强大的机械力支持以及孔隙结构用于物质交换。

与前面讨论的聚N-异丙基丙烯酰胺-透明质酸体系类似，未改性的PF127已经与双丙烯酸PF127（PF127-DA）混合，以打印具有促进提高细胞存活率的“纳米结构”支架。使用17%的未改性PF127和3%PF127-DA，研究人员能够在加热打印平台上打印出高分辨率的打印结构。然后使PF127-DA进行光敏聚合反应，当温度一旦降低至PF127的下临界温度，未改性的泊洛沙姆随即褪去，在打印结构中留下多孔隙结构。这些孔隙结构，即为“纳米结构”，可以将包裹在内的牛软骨细胞存活率从60%提升至86%。此外，尽管原始PF127-DA结构相当脆弱，压缩模量小于2kPa，但是加入甲基丙烯酸透明质酸后，其硬度可以增加4倍。

3.聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸（PLGA-PEG-PLGA）

是一种B-A-B三联共聚物，核心亲水基团与疏水基团侧翼（图7-2F）类似于泊洛沙姆。PLGA-PEG-PLGA共聚物可以通过形成微型颗粒产生热凝胶。这种反应的温度取决于许多因素，包括分子质量、乳酸和乙醇酸链的序列结构。基于这些因素，有些聚合物可以设计成室温为液态，温度到达体温后形成凝胶。不像泊洛沙姆，PLGA-PEG-PLGA共聚物是可生物降解的，并且其体内潴留时间更长。

PLGA-PEG-PLGA凝胶已广泛应用于药物输送。例如，使用PLGA-PEG-PLGA注射水凝胶可局部给药多柔比星20多天，在小鼠肉瘤模型中发现，与另外两种系统性给药方式相比，在同样的药物剂量下，热凝胶载药系统具有更显著的抗肿瘤作用。类似的，使用PLGA-PEG-PLGA热凝胶共聚物将辛伐他汀注入大鼠骨缺损模型，体外培养成骨细胞与辛伐他汀缓释水凝胶显示出更高的矿化程度和成骨表达。μCT分析结果显示，体内骨组织的骨密度显著性高于对照组。总的来说，PLGA-PEG-PLGA水凝胶作为注射给药系统具有很大的应用前景。

PLGA-PEG-PLGA共聚物也被用作组织工程的可注射体系。在兔模型中，一种共聚物被用来将骨髓间充质干细胞运送到全层关节软骨缺损处。该共聚物在原位形成支架，与天然组织有一定程度的结合。再生组织的力-位移曲线与对照组的曲线非常相似。此外，注射含细胞凝胶后杨氏模量和压缩模量均显著高于仅注射凝胶组，但与对照组相差不大。组织学结果也显示，糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的含量显著提高，但仍未达到对照水平。尽管如此，该体系在具有软骨再生能力的同时，还能减少瘢痕和宿主免疫反应。

4.其他合成聚合物

聚氨酯是热凝胶聚合物在再生医学技术领域应用的另一个案例，尤其是3D打印技术中具有巨大潜力。最近的研究工作集中在聚氨酯的开发上，以聚丙交酯-二醇或聚丙交酯-二醇为软性片段，二异氰酸酯为硬性片段。将神经干细胞包埋入聚氨酯生物墨水进行3D打印，然后将打印物植入中枢神经系统受损的斑马鱼模型中。80%以上的实验斑马鱼可以免于神经系统功能障碍。此外，在PLLA和PDLLA段中加入聚环氧乙烷进一步增强了凝胶形成能力，而聚氨酯生物墨水仅使用热凝胶就能达到约6.5kPa的模量，令人印象深刻。聚氨酯将是未来生物打印研究的重要材料。

此外，聚环亚氨基醚是另一种新型生物墨水。最近的一项研究使用了聚（2-代-2-唑啉）（POx）和聚（2-代-5，6-二氢-4H-1，3-唑啉）（POzi）的共聚物。该材料具有很高的触变性，剪切后可立即恢复。热凝胶材料的储存模量也相当高，约为1～2kPa。此外，这种生物墨水包裹的成纤维细胞，在打印后存活率超过90%。总的来说，聚环亚氨基醚生物墨水研究提供了另一种热凝胶材料，虽热该生物墨水在体内环境中还没有得到相应的验证，但也体现了对该材料研究的意义。