对血液病的定义与诊断，已从临床与细胞形态学的结合时期，发展到临床、形态学、细胞免疫学、细胞遗传学、分子学和其他生物学特征等信息的整合时期。但是，在临床上恰当而合理地应用各种项目是有分层和渐进性需求的，而项目的多样性，必然造成检查顺序安排的复杂性，也对项目选择提出了高的要求。有的通过外周血和骨髓细胞学的特异性就能作出有信心的诊断，如白血病的基本诊断（或类型分型）、贫血的一般类型；有的需要通过骨髓组织病理学检查才能发现疾病的根本异常（如骨髓纤维化和组织结构病变的MPN，骨髓再生障碍或造血衰竭的贫血）。有的需要通过免疫表型检查才能明确细胞系列或缺陷（如淋系肿瘤的B、T、NK细胞，阵发性睡眠性血红蛋白尿的异常细胞）；有些疾病的定义和细分特定类型的诊断，需要细胞遗传学和分子检查（如伴重现性遗传学异常的髓系与淋系肿瘤）。还有部分疾病，需要其他检查，如组织病理学、组织免疫化学以及特殊的形态学与细胞功能检查方可确诊（如淋巴瘤和白细胞功能异常疾病）。

加之，由于影响（细胞）形态学变化的因素日益增加，使得（细胞）形态学诊断的局限性和复杂性进一步凸显；又如一些细胞遗传学和分子学检查虽有异常特征但不一定发病等。因此，不管何种诊断方法，了解相关学科的基础、密切结合疾病的临床特征和相关实验室检查的信息变得更为紧密和重要。临床分析既是一切疾病诊断的起步，又是实验室诊断的首要组成，血液病的检验要以临床为前提。

形态学是重要的和基本的诊断方法。检测和分析免疫表型、细胞遗传学表型和基因表型特征则是定义疾病的重要组成，是当今细分特定类型（包括新类型）确诊的主要方法。但是，不同学科不同实验室检查都有长处与不足，还有各自学科的限定与特色，在不同疾病中显现各种方法特征的重要性也各不相同，而且随着资料的积累，也发现一些高特异性和高灵敏性方法不一定完美，故在整体上不存在定义与诊断全部疾病的金标准。相反，将多种方法整合评判，则会放大它们各自原有的临床意义。这些学科信息的互补性明显且互为学科基础，通过整合才会使诊断达到一种相对完美或更为精细（精准）的阶段。

血液病整合诊断学就是在这样的背景下，经实践检验而衍生的紧跟临床医学发展需要的一种新的诊断模式，也是在循证医学原则指导下的发展方向。在血液疾病，尤其是血液肿瘤，按整合的学科和方法分为几种场合下的整合诊断（图2-18）。同层面不同方法之间的优化整合，如四片联检；不同学科之间方法的优化整合，如形态学（morphologic, M）、免疫学（immunologic, I）、细胞遗传学（cytogenetic, C）和分子学（molecular, M），即MICM诊断模式；还包括可以收集的各种不同学科检查（如血清游离轻链、血清蛋白电泳和血清免疫球蛋白固定电泳联检）信息与临床特征之间的整合——多学科信息整合诊断。

四片联检中的每一片都有优缺点。血片观察红细胞和异常淋巴细胞具有优势，但不能深层了解造血情况；骨髓涂片观察细胞形态和细胞成熟性等具有优势，但评判细胞数量有不足，也不能观察造血的组织性病变；骨髓印片在细胞量和评判一些成熟淋巴细胞肿瘤方面显有优势，但观察组织结构和形态不及骨髓切片和骨髓涂片；骨髓切片检查组织结构性病变和免疫表型具有优势，但观察细胞形态明显不足。因此，只有通过优化组合的互补——整合，才是较佳模式，也是符合WHO分类中的形态学要求而有益于诊断。

形态学方法的优化整合加强了形态学基本诊断中的影响力。在白血病为主的血液肿瘤中，形态学的基本诊断地位尚无其他方法可以替代。形态学在没有其他参考信息情况下，多数或大多数还是可以作出其基本类型诊断的。故形态学是整合诊断中非常重要的一项大的内容，也常是后续检查与进一步特定类型诊断的前提。

流式细胞免疫表型检查具有方法和诊断上的许多优势（见第四章），除了血液肿瘤进行基本诊断与分类外，还可以对部分血液肿瘤作出进一步的特定诊断与分类，如WHO（2017）T-ALL特定类型的临时病种——早期前体T原始淋巴细胞白血病和NK细胞原始淋巴细胞白血病/淋巴瘤的免疫表型诊断。

可是，流式细胞免疫表型检查的不足也很明显。诸如理论上与实际上有一定的较大差距。尽管单抗是专一特异性，但一些肿瘤细胞无明确的特异性抗原标记，还由于肿瘤细胞的异质性，表面抗原出现跨系表达而影响对肿瘤类型的判断。故对于具体病例的诊断而言相当多情况下并没有理想效果。又如MDS，受到单抗种类的限制以及其他不足因素，对MDS的定性诊断与分类可能是最不容易明确的。

由于流式细胞提供的是events间接性信息，对一些信息的评判或界定不很明确，除了抗体的组合和标本因素外，一些细胞区域范围（包括表型特征）不明显，如单核细胞与幼粒细胞以及细胞碎片、血小板与有核红细胞（不易区分）；鉴定嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞尚不够准确。还需要流式细胞分析者排除碎片、细胞粘连及血小板黏附等出现的假阳性结果。界定的P ₁、P ₂等细胞群，圈定细胞范围时有模糊，会造成某一细胞群比例偏高偏低。反映出流式检查带有一些主观性，也容易漏掉极少肿瘤细胞的分析而出现假阴性。有核细胞增加与减少的相对性时有评判问题，如造血减低和血液稀释时的淋巴细胞比例增高与粒细胞减少症或缺乏症的中性粒细胞减少，常有混淆。干扰因素太多，存在任一因素都可以影响结果评判，诸如标本有微小凝块，影响细胞量又会影响仪器运行；浆细胞最易于凝聚，加之处理影响，可以出现PCM诊断的假阴性；标本放置时间过长，影响有效细胞的数量。流式图形分析显示粒细胞的成熟性和所含颗粒的多少，作为一个方法有它的特定含义和意义，但流式中重视的颗粒缺少的疾病谱偏宽，也不解释缺少的是嗜苯胺蓝颗粒还是中性颗粒。常规计数≥5万～10万个有核细胞，但与检测标本有核细胞中的目标细胞多少无关，故当骨髓稀释明显而异常细胞减少（如原始细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞）时，因目标细胞构成比例发生了变化而检出的细胞数常低于形态学检查。毫无疑问，不能真实反映骨髓内细胞的组成会影响定性与诊断。鉴定血小板和巨核细胞普遍不重视，对CML、 BCR-ABL1阴性MPN以及一些良性疾病的诊断明显不足。临床信息不详且病种多，对临床不提示的或超出流式常规单抗套餐时，实际上常会出现漏诊或影响分析的定性与诊断等。

还有三个显著性问题：一是缺乏流式细胞的参考区间；二是一部分肿瘤性原始细胞不表达CD34甚至HLA-DR等标记，MRD检测一些病人化疗后出现抗原的变异和丢失；三是流式检测并非一种简单的技术活，尤其是多色补偿需要多年的知识积累。

在参考区间方面，包括细胞的数量和质量，都没有很好建立。除了微小残留病灶检测多有一个不严格的参考范围外，报告单中大多有检测的各类细胞百分比，在描述或解释中也有这些细胞比例的变化或异常。很明显既然有检测的数值就会有参考区间。缺了参考区间，除了免不了带有随意性解释因素外，还不能对血液稀释（骨髓稀释）的程度做出适当的评估。例如报告的一部分细胞弱阳性，带有模糊性，部分阳性和阴性设定的范围也有欠缺。

二是原始细胞形态特征与免疫表型不一致。形态学根据形态学特征评判原始细胞，当原始细胞比例达到一定比例时，如>20%就可以归类为AML；而流式是间接性根据门内某一特定细胞群的比例和表达抗原特性评判的。如流式检查的原始细胞CD34和HLA-DR阴性，除了APL和嗜碱性粒细胞白血病外，还见于AML伴成熟型；甚至CD34、CD117阴性的一部分，是急性（粒）单细胞白血病等类型。即形态学检查，除了颗粒原始细胞外，无颗粒原始细胞也可以不表达CD34。这样，在流式分析中会造成混淆（如第四章图4-3）。三是流式检测和分析实际上是一个非常复杂的过程，涉及许多方面，如抗体的选择与合理设计、操作的技术与经验、结果的合理解释、形态学的结合与对照、临床特征的结合与不断更新的血液病诊断标准的掌握等，故专业上以“流式细胞术”称之。

时有所见的事实告诉我们：“整合互补”诊断是不可缺少的。流式免疫表型检查的长处与不足，恰与形态学形成互补，最重要的是流式与形态学都是快速且几乎都是同步的检查。两者的整合，灵敏度提高、特异性增强、结果易于分析、应用范围变得宽广。可以显著提高诊断的可靠性和精细化，并在第一时间提供临床诊治信息。因此，对没有改变诊断模式的实验室，建议临床送检流式细胞免疫表型时，附上1～2张骨髓涂片，极其重要。

基因检测技术（基因诊断）即分子技术（分子诊断）。通过分子技术可发现染色体畸变所累及的基因位置及其表达产物，检出细胞遗传学检查方法不能发现的异常，还能发现（尤其是核型正常者）癌基因突变、抑癌基因失活、凋亡基因受抑与DNA-染色质空间构型改变。此外，检查的主要方法，PCR检测快速、高效，其实用性价值大于细胞遗传学检测。分子异常特征的信息是造血和淋巴组织肿瘤定义的重要组成部分，是继形态学、细胞遗传学和免疫学技术之后的第四大类新技术。

检测染色体数量和结构的变异（染色体畸变）的细胞遗传学检查自20世纪60年代来，成为继形态学检查之后第二个可以对血液肿瘤进行诊断（血液肿瘤中特定类型或用细胞遗传学定义类型的确认）、预后评判、检测MRD和病情监测的大类技术。但是，染色体常规核型分析有明显的多个不足：一是时间影响，通常从接受标本细胞培养到发出报告需要10个工作日或更长；二是标本影响，如采集血液标本培养分析染色体，阳性低；三是药物影响，用药后影响染色体形态分析；四是常不能检出如白血病中存在的遗传水平上的隐蔽异常。此外，如果标本采集到达实验室时间偏长，细胞存活低而影响培养。

使用分子探针的FISH技术，是一种遗传学与分子学相结合的技术，具有经济、安全，实验周期短，可以发现一般核型技术不能发现的异常（如隐蔽异常），也可以对不易细胞培养的标本（如CLL和PCM）进行检测。不过，FISH的不足之处也存在：①不提供染色体全基因组评估；②所用探针的选择受临床疑诊的指导（鉴别诊断），不适合未知缺陷的筛查；③需要多个滤镜的高质荧光显微镜，以及可以检测出低水平发光的电荷耦合器件摄像机与先进的成像软件；④检测MRD，敏感性比RT-PCR等定量方法差（1∶100对1∶100 000）；⑤不同立体空间的荧光在镜下可重叠，可产生假阳性；⑥不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降；⑦报告时间偏长。

不管是细胞遗传学还是分子学，由于方法学本身，或是人为因素，都会影响到分析的结果。分子学和细胞遗传学诊断也需要与形态学和/或免疫表型检查进行整合，互相印证和提高（图2-18）。展望国情，首要的是完善形态学方法的整合，随后重视或加强形态学与免疫表型之间的整合，最后再与分子学和细胞遗传学等信息更紧密地整合，并熟悉相互之间的关系（如部分白血病和淋巴瘤的表型见表2-3和第一章表1-7）。

事实上，血液肿瘤分类是一种类似于通过临床和实验室的共同努力，对疑似患者进行逻辑性整合诊断。因在不同病例中，每种特征的相对贡献不同。只有掌握分类系统和各个病种的标准，才能选择适当的检查并以恰当的方式进行整合诊断。如WHO的AML分类，说明了在一个疾病亚组中，是如何根据不同特征来定义病种的。在具有重现性遗传学异常的AML中，形态学和遗传学是关键的；在伴骨髓增生异常相关改变AML中，形态学、临床病史和细胞遗传学在定义病种中具有同等的重要性；在治疗相关髓系肿瘤中，细胞毒性治疗或放疗的临床病史是能否归入这组肿瘤的最终因素。不另作特定分类（非特定类型）AML（AML，NOS）仍然由形态学定义。即使如CML，象征着WHO分类方法的楷模，是整合所有相关信息以定义病种的完美模型。这种白血病主要通过临床和形态学特征识别，并且始终与特定遗传学异常，即 BCR-ABL1基因关联。该融合基因编码的融合蛋白足以引起白血病，也提供了治疗的靶标，延长了患者的生命。然而，也有不足（如 BCR-ABL1不只见于CML），不是任何单个参数可以诊断或完美解决临床问题的。

又如，在以前的MPN分类方案中，检出Ph或 BCR-ABL1融合基因用于CML的确诊。剩余的 BCRABL1阴性MPN类型，如PV、PMF和ET的诊断规则较为复杂，包括非特异性临床和实验室特征用于区分各个类型以及容易混淆的反应性骨髓增生。2005年发现的 JAK2 V617F和类似突变几乎见于所有的PV和一半以上的ET和PMF，从而改变了这些肿瘤的诊断标准。之后，在许多 JAK2阴性MPN病例中又发现了 MPL突变及更常见的 CALR突变。这些突变，尽管不是某种MPN类型的特异性指标，但检测到这些突变可确定为克隆性，使这些MPN与反应性骨髓增生的鉴别变得容易。然而，对于无这些突变的ET和PMF患者，肿瘤性和反应性的区别依旧不容易，没有 JAK2 V617F或类似的激活突变不能排除MPN。此外，有突变也不能区分MPN类型，照样需要引入其他的标准。有意思的是在过去十年中，对MPN组织学特征方面有了更多的认识：特定的组织病理形态学特征作为诊断参数的重要性得到公认，如巨核细胞的形态和分布位置，骨髓基质的改变以及增殖细胞的系列与临床特征的对应关系。因此，现在的MPN诊断规则包括临床、血液学、遗传和组织学数据，可以准确地识别和分类各种类型。

因此，从整体上看，面对疑似血液肿瘤的患者，毫无疑问，形态代表并将继续代表诊断过程的基本步骤。也无疑问，我们所讨论的“诊断”更多地包含了对预后的更好评判、对治疗的导向性选择、对病理机制的深层解释诸方面含义。因此，如有可能，建立和完善与形态学互动的流式细胞免疫表型、细胞遗传学和分子学等技术相整合的一个部门实验室，更能增强诊断的系统性和互补性。

临床特征是实验室诊断的重要组成，血液病的检验要以临床为前提，以形态为本，整合同学科和不同学科技术，尽可能使发出的整合诊断报告更加放心和踏实。我们提出的理念与服务是：紧贴临床（了解临床、熟悉临床、结合临床）、形态为本（血液病诊断的基本技术之本）、整合诊断（作出精细的疾病类型诊断和病损程度的评判）、满意临床（临床满意反映的是实验室质量之根）和学术提升（总结与研究，提升自我）。作者实验室从2002年开始使用形态学四片联检整合诊断报告，从2014年开始实施流式免疫表型与形态学相结合的整合诊断报告，以及多学科信息的造血和淋巴肿瘤整合诊断报告。

髓系肿瘤的诊断需要临床医生和病理学家协调并仔细地评估临床、形态学、免疫表型和遗传学数据（表2-4）。诊断经常基于不充分的临床和实验室信息，特别是不恰当的诊断标本。一个经验法则是，形态学是诊断所有髓系肿瘤的关键标准，即使是存在密切相关的遗传学异常或特征性免疫表型者。如果样本不足以评估形态，应重新获取样本。

采集初诊外周血和骨髓标本，通过形态学、细胞化学和免疫表型检查，确定肿瘤细胞的系列并评估其成熟性。原始细胞百分比仍然是对髓系肿瘤进行细分类型并判断其进展的实用工具。血液或骨髓中≥20%为AML，若发生在有MDS或MDS-MPN病史的患者，则为该病演变的AML，或先前诊断为MPN者则称为急变。任何水平上逐渐增多的原始细胞数，通常与疾病进展相关。在可能的情况下，原始细胞百分比应当从Wright-Giemsa或相似染色的外周血涂片的200个白细胞和骨髓涂片上500个有核细胞中分类得到。原始细胞形态定义按骨髓增生异常综合征形态学国际工作组的标准。流式检测到CD34+细胞较形态学评估所预期的CD34+细胞更多时需重新评估两个标本以解决差异。如可以鉴定最初与淋巴细胞混淆的异常的小原始细胞，还是因红系增生标本经流式溶解幼红细胞后使CD34+细胞数错误地升高。髓系肿瘤也可以通过骨髓切片标本免疫组化进行检测。不过，肿瘤性髓系细胞不同步表达成熟相关抗原并不少见，以流式检测为佳。

虽然，并非每位髓系肿瘤患者都需要骨髓活检，但合格的活检标本可以准确地评估骨髓增生程度、各种组织分布、基质变化和各系细胞的成熟模式，并且在治疗后的残留病检测中很有价值，尤其当骨髓涂片标本不佳时。

常见髓系肿瘤中细胞遗传学和分子学检查的所需与例举见表2-5。