实验十　理化及生物因素对细菌的影响

微生物和其他生物一样，与外界环境有着密切的联系。外界环境适宜，微生物就生长繁殖；条件改变过于剧烈，微生物的各种代谢可能发生改变，甚至菌体内蛋白质变性凝固，则会导致其生长停滞、死亡。在医学上常用人工方法，给微生物造成极为不利的环境来达到杀灭微生物的目的。同时，据此亦可用来测定细菌对抗菌药物的敏感性。

一、紫外线的杀菌作用

【实验目的】

了解紫外线杀菌的原理及影响因素。

【实验原理】

波长为200～300nm的紫外线对细菌有杀灭作用，其中波长为265～266nm的紫外线杀菌作用最强。细菌经紫外线照射后，可在DNA中形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了DNA的复制，使细菌死亡。但紫外线的穿透力弱，可被普通玻璃及纸片吸收，因此应用受到限制，只用于手术室、无菌室、烧伤病房和传染病房等处的空气或物体表面消毒。

【实验材料】

1. 菌种：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌培养液。

2. 普通琼脂平板、中心穿孔的黑色纸片、无菌棉签、紫外灯箱等。

【实验方法】

1. 用无菌棉签分别取大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌培养液，各均匀涂布于一块普通琼脂平板表面，分别做好标记。

2. 在紫外灯箱内打开皿盖，将已接种细菌的平板放置在紫外灯下，取一中心穿孔的黑色纸片盖于平皿上，打开紫外灯，照射30分钟后除去纸片，盖好皿盖，置37℃温箱中培养18～24小时，取出观察结果。

【实验结果】

在黑色纸片中心穿孔处，紫外线能照射到平板上，因此这一区域无细菌生长，而在黑纸遮住部位，细菌生长旺盛，形成菌苔。

二、热力对细菌的作用

（一）高压蒸汽灭菌器

【实验目的】

了解高压蒸汽灭菌器的原理及使用方法。

【实验原理】

高温对细菌具有明显的致死作用，高温可以使菌体内的蛋白质凝固变性，从而使细菌死亡。高压蒸汽灭菌器是使用热的水蒸气进行灭菌的器具。水在一个大气压下，在100℃左右沸腾形成水蒸气，气压增加沸腾温度将随之升高。因此，在密闭的高压灭菌器内，当压力表指示蒸汽压力增加到103.4kPa（1.05kg/cm2）时，温度可达121.3℃，在这种温度下，15～20分钟即可杀死一切微生物，包括细菌的芽孢。

【仪器构造】

以手提式高压蒸汽灭菌器为例（图1-19）。它是一双层筒状金属容器。外壁坚固，能承受一定的压力。外壁顶端有一金属厚盖。盖旁加有螺旋，借以紧闭此盖，防止蒸汽外溢。盖上装有排气阀门，内连排气管，还有安全活塞和温度压力表。另有一内层金属筒。内壁有安装排气管的金属槽，底部有带孔的金属搁板，盛放欲灭菌的物品。

【使用方法】

在外壁内面的底部加入适量的水，然后放入内层金属筒。将待灭菌物品放入内层金属筒的搁板上。加盖，注意将盖上的排气管插入内壁金属槽内。旋紧螺旋使之密闭，同时打开排气阀门；打开电炉开关加热（也可用煤气灶或炉火加热）；温度逐渐上升，盛入的水沸腾、汽化，随着压力的增高，迫使灭菌器内冷空气先由排气阀门排出，继而有蒸汽出现，待有大量蒸汽喷出时（呈白色雾状气流，并发出哨音），即可认为器内冷空气已被排尽；关闭排气阀门，灭菌器内压力逐渐上升，随着蒸汽压力的增高，器内温度也随着升高。直到压力表指示为103.4kPa（1.05kg/cm2），灭菌器内温度可达121.3℃，调节热源使压力和温度维持在此数值，经15～20分钟，即可达到灭菌的目的。灭菌时间到达后，停止加热，待灭菌器内压力自行下降到零时，才能开盖取物。

【注意事项】

1. 灭菌开始时，必须将灭菌器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力不完全是蒸汽的压力，灭菌将不彻底。

2. 灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门放气减压，以免器内被灭菌的瓶内液体因压力突然降低而冲出外溢。要待压力自行下降到“0”时，才能开盖取物。

3. 需要灭菌的物品放置不能太挤，以免妨碍蒸汽流通，影响灭菌效果。要根据物品体积的大小适当调整灭菌的时间。

4. 要特别注意安全，使用前要注意检查排气阀门和安全阀门，特别是压力表的性能是否正常，以免发生危险。

（二）干热灭菌器（干烤箱）

【实验目的】

了解干热灭菌器的原理及使用方法。

【实验原理】

干热灭菌器是利用热空气进行干热灭菌的常用器具。在一个密闭的容器内，利用箱底电热丝圈产生的高温，使被灭菌物品中的细菌因菌体蛋白发生变性、凝固而死亡。

【仪器构造】

干热灭菌器是具有双层壁结构的长方形或方形金属箱，外壁内层装有隔热的石棉板，用以保持箱内温度。箱底有电热丝圈，通电后作为热源。顶上有多个侧孔及一中央孔，侧孔供空气流通，中央孔则用于安装温度计。箱前有金属门和玻璃门，箱内有金属板架数层，供放置待灭菌的物品。箱的前下方或一旁装有温度调节器，用以调节和控制所需的温度（图1-20）。

【使用方法】

各种玻璃及陶瓷器皿、非挥发性油类如液体石蜡、凡士林等耐高温和耐干燥的物品，可置箱内灭菌，但灭菌前须使器皿干燥，并分别塞好棉塞，用废旧报纸包好或装入金属筒内，并将包装好的待灭菌物品放入箱内金属板架上，关好箱门，接通电源加热，热空气在夹层中间循环，然后经一个或几个小孔进入箱内；当温度上升至160℃，保持2小时，关闭电源，停止加热；待温度自然下降至40℃以下时方可开门取物。

【注意事项】

1. 箱内温度不可超过180℃，否则棉塞和包扎的纸张将被烤焦。

2. 灭菌后，必须等待箱内温度自然下降到与外界温度相差不多时，才可开门取物，否则冷空气骤然进入，易使玻璃器皿炸裂；且高温的热空气外溢，往往会灼伤取物者的皮肤。

【思考题】

什么是灭菌，举两个常用方法说明。

三、化学消毒剂对细菌的影响

【实验目的】

了解化学消毒剂的杀菌作用。比较不同消毒剂对细菌的作用效果。

【实验原理】

化学消毒剂通过促进菌体蛋白质凝固变性、干扰细菌的酶系统和代谢及损伤细菌细胞膜等机制影响细菌的化学组成、物理结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒甚至灭菌的作用。

【实验材料】

1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌。

2. 培养基：普通琼脂平板、普通肉汤培养基。

3. 试剂：0.1%新洁尔灭、5%石炭酸、2%戊二醛、2.5%碘酊。

4. 其他：灭菌滤纸片、无菌棉签、无菌镊子、生理盐水、1ml无菌吸管。

【实验方法】

1. 用无菌吸管分别吸取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的肉汤培养物0.1ml，滴入一普通琼脂平板的中央，用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面。

2. 待普通琼脂平板表面菌液干后，用无菌镊子夹圆形滤纸片，分别浸于生理盐水、0.1%新洁尔灭、5%石炭酸、2%戊二醛、2.5%碘酊中，将纸片与试管内壁接触以除去多余药液，轻轻贴在普通肉汤培养基表面，每个纸片的距离约2.5cm。

3. 注明标识后，将普通琼脂平板放置培养箱内，37℃温箱中培养24小时后观察结果。

【实验结果】

在含有化学消毒剂滤纸片的周围细菌生长被抑制，形成抑菌环，测量抑菌环直径，并比较几种含有化学消毒剂滤纸片抑菌环直径的差别。

四、细菌对抗菌药物的敏感性试验（纸片扩散法）

测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验。药敏试验是使用体外试验的方法检测细菌的耐药性，预测抗菌药物的临床治疗效果，在药物种类的选择上为临床医生提供帮助，以实施个体化治疗。常用的试验方法包括纸片扩散法、稀释法、自动化仪器法、E-TEST（浓度梯度法）。

【实验目的】

1. 通过实验证实临床常用抗菌药物的抑菌作用。

2. 初步掌握抗菌药物体外抑菌试验的操作方法和意义。

【实验原理】

某些微生物（主要是放线菌、真菌和细菌）新陈代谢过程中所合成的一种化学物质称为抗生素，如青霉素、头孢菌素等；由化学合成的相同或类似的物质称化学合成抗菌药物，如甲硝唑、喹诺酮类等，二者合称为抗菌药物。抗菌药物能抑制或杀灭某些其他的病原微生物或癌细胞。这种抑菌作用有多种体外检测方法。临床最常用的是纸片扩散法，即在均匀涂布有细菌的培养基表面，贴上沾有抗菌药物的滤纸片，经培养后，在滤纸片周围出现透明的无菌区，说明该抗菌药物对试验菌有抑制作用。若不出现透明的无菌区，则说明该抗菌药物对试验菌无抑制作用。无菌区越宽说明抑制作用越强。还可用试管稀释法或平板稀释法来测定药物的最低抑菌浓度。即用一定量的培养基将药物进行倍比稀释，然后在每管中加入一定量的试验菌，经培养后，凡最高稀释度管中无菌生长者为该药物的最低抑菌浓度（MIC）。

【实验材料】

1. 菌种：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌6～8小时肉汤培养物，校正浓度至0.5麦氏浓度。

2. 其他：普通琼脂平板、灭菌的圆滤纸片（直径6mm）、抗生素纸片（青霉素、链霉素和庆大霉素）、无菌生理盐水、眼科镊子、灭菌棉签、酒精灯等。

【实验方法】

1. 每人取普通琼脂平板一个（图1-21），在平皿底部玻璃面上做好标记，按无菌操作取无菌棉签一支蘸取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌6～8小时肉汤培养物（二人合作，一人取金黄色葡萄球菌，另一人取大肠埃希菌），在试管内壁旋转挤去多余菌液；然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°；最后沿平板内缘涂抹1周；用过的带菌棉签丢入盛有消毒液的缸内。

2. 将眼科镊子在酒精灯的灯焰上烧灼灭菌，待冷却后，分别夹取青霉素、链霉素、庆大霉素纸片和生理盐水溶液中的滤纸片一张，使其与盛药器皿内壁接触，然后按标记贴在已涂布有细菌的琼脂培养基表面，纸片间的距离要大致相等。注意，每取一种药物纸片后，镊子要在酒精灯的火焰上烧红，以除去原药液后，再取另一药物纸片。

3. 然后将普通琼脂平板底朝上，盖朝下，放入37℃温箱中培养18～24小时后观察结果。

4. 抗菌药物的选择：参照表1-3选择药敏纸片。

【实验结果】

取出观察纸片周围有无抑菌环，测量并记录抑菌环直径大小，按表1-4判断出细菌对药物的敏感程度，按表1-5记录结果。敏感（S）：用常规用量治疗有效；耐药（R）：用常规用量治疗不能抑制细菌的生长；中介（I）：MIC接近血液、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株，药物生理浓集部位有效，加大用药物剂量可能有效。