实验九 细菌代谢产物的检查
细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的利用能力各异，因而在代谢过程中所产生的代谢产物也不同。应用生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌属、种的鉴定。这种利用生物化学方法来鉴别细菌的试验，统称为细菌生化反应，是鉴定细菌的重要方法之一。
一、糖发酵试验
【实验目的】
掌握糖发酵试验的原理及结果观察的方法。
【实验原理】
各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别细菌。
【实验材料】
1. 微量生化反应管、糖发酵管（葡萄糖、乳糖）。
2. 成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麦芽糖等，溴甲酚紫等指示剂。
【实验方法】
将细菌接种于糖发酵管中，37℃温箱中培养18～24小时后观察结果。必要时可培养更长时间后再判定结果。
【实验结果】
观察结果时，首先确定有无细菌生长，有细菌生长时，培养液常呈混浊状。细菌若分解糖，则产酸，使指示剂变色（一般记录符号是“+”）；有些细菌在分解糖的同时还产生气体，则倒立小管中有气泡出现（记录符号为“⊕”）；细菌若不分解糖，指示剂不变色，不见培养液混浊（记录符号为“-”）。
二、靛基质（吲哚）试验
【实验目的】
掌握靛基质试验的原理及结果观察。
【实验原理】
有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质，与靛基质试剂（对二甲基氨基苯甲醛）产生红色化合物。
【实验材料】
1. 微量生化反应管、蛋白胨水培养基。
2. 成分：蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、蒸馏水100ml、靛基质试剂。
【实验方法】
将细菌接种于蛋白胨水培养基中，37℃温箱中培养18～24小时后观察结果。
【实验结果】
滴加数滴靛基质试剂于蛋白胨水培养基的液面上，其接触面呈玫瑰红色则为阳性，仍呈黄色则为阴性，若颜色不明显，可再加1～2滴乙醚，振荡试管使乙醚分散于液体中。若培养液中有靛基质存在，就可以被提取至乙醚层中，颜色反应较为明显。
三、甲基红试验
【实验目的】
掌握甲基红试验的原理及结果观察。
【实验原理】
某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解产生甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红试剂后呈红色（阳性）。有些细菌分解葡萄糖产生的酸性物质进一步转化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红试剂呈黄色（阴性）。
【实验材料】
微量生化反应管、葡萄糖蛋白胨水、甲基红试剂。
【实验方法】
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃温箱中培养24小时后，再向其中加入甲基红试剂1滴，观察结果。
【实验结果】
出现红色反应为甲基红试验阳性，出现黄色反应为甲基红试验阴性。
四、V-P（Voges-Proskauer）试验
【实验目的】
掌握V-P试验的原理及结果观察。
【实验原理】
某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步脱羧基生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酸肌酐，可以加速其反应。
【实验材料】
微量生化反应管、葡萄糖蛋白胨水、V-P试剂（6%α-萘酚乙醇溶液、40%氢氧化钾溶液）。
【实验方法】
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃温箱中培养24～48小时后，滴加6%α-萘酚乙醇溶液2滴，再滴加40%氢氧化钾溶液1滴，充分振荡后，室温下静置15分钟后观察结果。
【实验结果】
呈红色反应为阳性，若无红色反应出现，且置37℃温箱中培养4小时后仍无红色者为阴性。
五、枸橼酸盐利用试验
【实验目的】
掌握枸橼酸盐利用试验的原理及结果观察。
【实验原理】
当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，并分解枸橼酸盐为碳酸盐，使培养基变为碱性，指示剂溴麝香草酚由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐为碳源，则细菌不能生长，培养基不变色，仍为绿色。
【实验材料】
枸橼酸盐斜面培养基。
【实验方法】
将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37℃温箱中培养48小时后观察结果。
【实验结果】
培养基上有细菌生长，而且培养基由绿色变为深蓝色者为阳性；若培养基上无细菌生长，培养基颜色不变，仍保持绿色则为阴性。
六、硫化氢试验
【实验目的】
了解硫化氢试验的原理。
【实验原理】
某些细菌能够分解培养基中的含硫氨基酸（如半胱氨酸、甲硫氨酸），生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。沉淀物愈多，表示生成的硫化氢愈多。
【实验材料】
微量生化反应管、醋酸铅培养基。
【实验方法】
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37℃温箱中培养24小时后观察结果。
【实验结果】
培养基出现黑色沉淀为阳性，不变色为阴性。
七、尿素分解试验
【实验目的】
了解尿素分解试验的原理。
【实验原理】
具有尿素酶的细菌能够分解尿素产氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变为红色。
【实验材料】
微量生化反应管，尿素培养基。
【实验方法】
将细菌接种于尿素培养基中，37℃温箱中培养18～24小时后观察结果。
【实验结果】
培养基变为红色则为阳性，不变色则为阴性。
八、明胶液化试验
【实验目的】
了解明胶液化试验的原理。
【实验原理】
某些细菌具有明胶酶，能分解明胶为多肽，并进一步分解为氨基酸，使明胶失去凝固力。
【实验材料】
微量生化反应管，明胶培养基。
【实验方法】
将细菌穿刺接种于明胶培养基中，置22℃温箱中培养5～7天，逐日观察结果（若在盛夏时节，无22℃培养条件时，可放35℃温箱中培养，但在此温度下，明胶培养基呈液体状态，故应将培养物置4℃冰箱30分钟后观察结果）。半固体状态的明胶培养基成为液体状态为阳性，培养基仍然为半固体状态则为阴性。
【实验结果】
将细菌生化反应结果记录于表1-2中。
表1-2 细菌生化反应结果
注：可以用以下符号表示实验结果。“0”表示未做；“⊕”表示产酸产气；“+”表示阳性；“-”表示阴性
【思考题】
1. 大肠埃希菌与产气杆菌均是革兰阴性菌，形态上不易区分，可以利用哪些生化试验加以鉴别？
2. 利用糖的分解代谢鉴定细菌常用的生化试验有哪些？