口腔肿瘤生物学:基础和临床
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第四节 口腔肿瘤细胞迁移机制研究的方法和技术 Section 4 Methods and Techniques of Oral Tumor Cell Migration Mechanism

一、细胞培养技术
细胞培养技术也叫细胞克隆技术,在生物学中的名词为细胞培养技术。无论对于整个生物工程技术,还是其中之一的生物克隆技术来说,细胞培养都是一个必不可少的过程,细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞生长需要一定营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞生长提供营养及通气的表面,在这样营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此,固体培养基在细胞分离、鉴定、计数等方面具有重要作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得细胞以及对细胞进行体外改造、观察,必须首先解决细胞离体培养问题。与微生物细胞培养的难易相比,来自多细胞生物的单细胞培养相对困难,特别是动物细胞培养。
二、动物模型的建立
在动物实验中,人们发现动物在生命活动中的生理和病理过程与人类或异种动物都有很多相似之处,并可互为参照,一种动物的生命活动过程可以成为另一种动物乃至人类的参照物。这样就赋予动物实验更广泛的意义,也使动物模型的建立成为可能。关乎人类本身的研究,在人体上进行试验,风险很大;对一些数量很少的珍稀动物,或一些因体型庞大,不易实施操作的种类,往往用取材容易,操作简便的另一种动物来进行实验研究,代替人类或原来的目标动物,这就是动物实验。为了保证这些动物实验更科学、准确和重复性好,用各种方法把一些需要研究的生理或病理活动相对稳定地显现在标准化的实验动物身上,供实验研究之用。这就称之为动物实验的动物模型。
三、基因芯片技术
1998年底美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一,足见其在科学史上的意义。现在,基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥(arabidopsis thaliana)、酵母(saccharomyces cerevisiae)及人的基因组表达情况进行研究,并且用该技术(共157 112个探针分子)一次性检测酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异。实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析,例如对人BRCAⅠ基因外显子11、CFTR基因、β-珠蛋白生成障碍性贫血、酵母突变菌株间、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因(与Sanger测序结果一致性高达98%)等突变检测,对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型,人线粒体16.6kb基因组多态性研究等。将生物传感器与芯片技术相结合,通过改变探针阵列区域的电场强度,已经证明可以检测到基因(如 ras等)的单碱基突变。此外,通过确定重叠克隆的次序进而对酵母基因组作图。杂交测序是基因芯片技术的另一重要应用,该测序技术理论是高效可行的测序方法,但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导目的核酸分子的序列。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子,为杂交测序提供实施的可能性,这已经为实践所证实。
在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。其将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径,为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。其将生命科学研究所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测),利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统,使之连续化、集成化、微型化。生物芯片技术主要包括四个基本要点:芯片方阵构建、样品制备、生物分子反应和信号检测。芯片制备,先将玻璃片或硅片进行表面处理,然后使DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在芯片上。样品制备,生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理,获取其中的蛋白质或DNA、RNA,并且加以标记,以提高检测的灵敏度;生物分子反应,芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配比率。芯片信号检测,常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中,通过扫描以获得有关生物信息。
四、阻断剂的应用
为了研究某一蛋白质在细胞迁移中所扮演的角色,一般来说可以将某蛋白的编码基因进行突变,甚至应用新近的RNAi现象,或者加入该蛋白质的阻断剂(inhibitor)来抑制某一蛋白质表达,并且分析此抑制作用对于细胞迁移的影响,反而得知被抑制的蛋白质与细胞迁移的关系。
五、ECIS技术和ATIM的应用
电子细胞基质阻抗判断(electric cell-substrate impedance sensing,ECIS)可以观察细胞在传统细胞培养甚至是液体环境的移动行为。根据观测细胞电学参数的能力,量化测量肿瘤细胞迁移过程中细胞层形态变化。同理,在肿瘤研究领域,荧光协助转移侵入和运动分析法(fluorescence-assisted transmigration invasion and motility assay,ATIM)提供快速定量细胞侵入(细胞从一个区域进入另一区域)方法,允许检测大量样品和不同条件下时间依赖性侵入。更重要的是,这一系统可以方便地通过在多孔膜上增加胞外基质的厚度来监测细胞侵入结构的深度。韩国延世大学朴宗哲和朴峰珠发明了一套细胞跟踪系统,由计算机辅助的时间流逝显示微观复制系统,其中有影像形成过程软件,其程序编制含有自动影像分析和自动设计CO 2微小细胞培育器,功能是在倒置显微镜平台上,对于细胞迁移进行迅速而精确的分析,形成对于细胞的培育。目前已运用这一计算机辅助系统计算细胞外基质覆盖表面的细胞迁移过程。
斑马鱼是目前在该领域最常用于研究的生物。细胞迁移是脊椎动物胚胎发育的核心过程之一。细胞从原分裂生成的部位移动到目的部位就是细胞迁移。斑马鱼的优势包括:首先,其胚胎能在母体外发育,速度快,受精24小时后身体的器官大部分已经就位;其次,斑马鱼繁殖量大,容易对之进行变异;此外,其胚胎透明,在高分辨率快进摄影技术的帮助下,可以很好观察细胞迁移过程,利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可以观察到细胞在斑马鱼体内的分布情况。