第四节 功效成分的提取分离方法各论

从药食两用中药中分离纯化功效成分，并发展新药和寻找先导化合物是药物开发的重要内容。中药所含的成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。因此在进行药食两用中药生产过程中一般都要从药材的前处理到提炼处理粉碎处理，之后经过制剂加工生产为成药。其中提炼处理的本质，是通过“分离”，从中药材中去粗存精，去伪存真，从而获取药效物质的过程。中药生产每一阶段都包括一个或若干个混合物的分离操作，分离过程就是将一混合物转变为组成互不相同的两种或几种产物的操作，其目的是最大限度地保留有效成分或有效部位，去除无效和有害的成分，即中药分离纯化的目的是得到“功效成分”，以达到为不同类别新药和剂型提供合格的原料或半成品的目的，分离纯化技术是改变传统中药制剂“粗、大、黑”的关键，使得传统中药领域向现代化、科学化、产业化、精细化、标准化的方向迈进，以实现我国中药产业跨越式发展。

常见的分离纯化方法有水提醇沉法、醇提水沉法、酸碱沉淀法、盐析法、滤过分离法和结晶法等，各有其优越性，但这些方法在长期的应用中，都存在一些缺点或需要改进的地方。如提取时间长，提取效率低，或溶剂用量大，操作繁琐，或不利于热不稳定或挥发性成分的提取等，因此人们一直在研究探索更有效的方法。

近年来，随着科学技术的高速发展，使得天然产物有效成分的分离纯化技术取得了很大的进展，越来越多的新技术、新方法被运用到中药有效成分的提取分离研究上，如柱色谱法、亲和色谱技术、膜分离技术、毛细管电泳技术、分子印迹技术、分子蒸馏技术、新双水相萃取技术、超临界流体萃取技术及各种技术的联用技术等。其中膜分离技术中的超滤技术，具有分离过程无相变、分离效率高、无需添加化学试剂、无需加热能耗低、条件温和、无破坏成分、操作方便且流程短的特点，能够部分取代传统的过滤、吸附和萃取等分离技术，已开始广泛应用于中药制剂工艺中；大孔吸附树脂具有选择性吸附有机化合物的能力，对色素的吸附能力较强，经大孔树脂吸附技术处理后得到的精制物可使药效成分高度富集，杂质少；离子交换树脂为高效、高选择性纯化生物碱的专用吸附树脂；交联葡聚糖凝胶柱色谱虽然价格昂贵，但其具有优良的吸附性能，只需很少量的凝胶就能将大体积溶液中的微量物质选择性地吸附富集，在中药化学中广泛用于多糖类高分子物质的分离。这些新技术具有传统方法无法比拟的优点，对提高中药制剂质量、减少服用剂量、提高生产效率、降低环境污染等方面起到积极的推动作用，在中药分离中有着广泛的应用前景。可以预见，新技术在中药有效成分提取分离领域中的广泛运用，必将极大地推动中药产业的发展和中药现代化进程。我们应该加快利用先进的提取分离技术和设备，提高中药有效成分的收率和纯度，确保中药制剂质量与疗效，从而为中药制剂实现现代化，走向国际市场奠定基础。

以下根据化学成分分离，对各类型功效成分的提取分离方法进行具体介绍。

（一）糖和苷类的提取与分离

1．糖类的提取

糖类是极性大的中药成分，能溶于水和稀醇，不溶于极性小的溶剂，从中药中提取糖时，一般都是用水或稀醇提取。由于多种物质共存的助溶作用，用乙醇（甲醇）回流提取也可提出单糖和一些低聚糖。由于植物内有水解聚合糖的酶与糖共存，必须采用适当的方法破坏或抑制酶的作用，以保持糖的原存形式。提取时可采用加入无机盐（如碳酸钙），或加热回流等方法破坏酶的活性。若共存有酸性成分，还应用碳酸钙、碳酸钠等中和，尽量在中性条件下提取。多糖以及分子量较大的低聚糖可用水提取，根据多糖的具体性质的不同，有的也可用稀醇、稀碱、稀盐溶液或二甲基亚砜提取。多糖常与其他成分共存于中药中，可利用多糖不溶于乙醇的性质，在提取液中加乙醇、甲醇或丙酮使多糖从提取液中沉淀出来，达到初步纯化的目的。

2．苷类的提取

由于中药中原生苷、次生苷、苷元的存在状态和性质不同，其提取方法有较大的差别。因此，苷类的提取，首先要明确提取的目的和要求，即要求提取的是原生苷、次生苷，还是苷元，然后根据要求进行提取。

在中药研究，特别是对未曾研究过的药物、或未知的成分进行研究时，需要尽量保持化学成分原来的存在状况，要求提取原生苷。在生产中，很多中药的有效成分是原生苷，也要求提取原生苷。在植物体中，苷类往往是与能水解苷的酶共存，因此，在提取原生苷时，首先要设法破坏或抑制酶的活性，以避免原生苷被酶解，常用的方法是采用甲醇、乙醇或沸水提取，或者在药材原料中拌入一定量的无机盐（如碳酸钙）。其次在提取过程中要注意避免与酸或碱接触，以防酸或碱破坏欲提取成分的结构。如果药材本身呈一定的酸碱性，可用适当的方法中和，尽可能在中性条件下提取。

如果要求提取次生苷，可根据具体的产品要求，有目的地控制和利用酶、酸或碱的水解作用，采取诸如发酵、选择性部分水解的方法处理药材，以提高目标提取物的产量。

也经常结合树脂吸附法来提取总苷，一般选用非极性或极性小的大孔吸附树脂。其主要方法是将中药按上述方法经溶剂浸出，脱脂后用氯仿或乙酸乙酯提取脂溶性部位，然后不用正丁醇提取，而是用大孔吸附树脂柱色谱来富集、纯化总苷。

3．糖的分离

如提取物中有含量很高的单糖或二糖，可尝试用结晶方法分出。但糖混合物一般需要通过色谱的方法进行分离。常用活性炭、大孔吸附树脂、纤维素等进行色谱分离。此外，也可用硅胶及反相硅胶进行色谱分离。

以活性炭柱色谱分离糖类时，可将糖混合物以适量的水溶解，加到活性炭柱的顶端，以缓慢的流速让其充分吸附。先用水洗脱，最先洗下的一般是无机盐和氨基酸，同时或稍后洗下的是单糖；洗下单糖后，用逐渐增加浓度的稀醇洗脱，大约10%（V/V）的稀醇可洗下二糖，15%（V/V）的稀醇可洗下三糖。随着醇浓度的增加，依次洗下分子量较大的糖，一般35%～45%（V/V）的稀醇即能洗下所有的单糖和低聚糖。大孔树脂色谱一般选用非极性或低极性大孔树脂作吸附剂，洗脱的溶剂系统和方法基本同活性炭柱色谱。纤维素色谱分离糖类，一般可获良好分离效果，溶剂系统可用水、稀乙醇、稀丙酮、水饱和正丁醇或异丙醇等。但对酸性多糖，可在溶剂系统中加入适量的乙酸（甲酸），以避免拖尾。对于多糖的分离，一般采用分级沉淀法精制后再用色谱法分离。分级沉淀的方法即将多糖水提取液适当浓缩后，加入一定量的乙醇（丙酮）至不同的浓度，使多糖分级沉淀，得到不同的多糖组分。此外，多糖中的小分子物质可用透析法除去。一般经分级沉淀法得到的粗多糖常混有较多的蛋白质，必须予以除去。现多采用三氟三氯乙烷法和Sevag法，即正丁醇-氯仿按1∶4混合后与多糖水溶液振摇，放置，使蛋白质变性沉淀。此外，琼脂糖凝胶（商品名Sepharose，Bio-gel A）和聚丙烯酰胺凝胶（商品名Bio-gel P）也都可用于多糖类的分离。凝胶滤过色谱分离多糖较为理想，分子大小不同的多糖在分离过程中不断扩散和排阻，大分子多糖先流出，小分子多糖后流出。常用的葡聚糖凝胶有Sephadex G-50、G-75、G-150等。酸性多糖在电场作用下向两极迁移的速度不同，可用电泳法分离。多糖在超离心条件下，由于分子大小不同，其沉积速率不同，故也可用超速离心法分离多糖。

4．苷的分离

苷类是极性较大的成分类型，且基本上是非结晶性物质，分离较为困难，在提取后一般先经初步精制除去大量杂质，再用色谱法分离。初步精制的方法有溶剂法和大孔树脂法。溶剂法是将粗提物溶于少量甲醇（水），再滴加丙酮（或乙醚），使苷类沉淀析出而精制。大孔树脂法是将粗提物溶于水，吸附于大孔树脂柱上，先用水洗去无机盐、糖、肽类等水溶性成分，再用逐步增加浓度的稀醇洗脱苷类，此法也可用于苷类的分离。苷类的色谱分离一般要综合应用各种色谱法，包括高效液相色谱等，才能彼此分离。常用硅胶、反相硅胶、葡聚糖凝胶等色谱材料来分离苷类。有些苷类也可用活性炭、纤维素、聚酰胺、离子交换树脂等色谱材料来分离。硅胶是用于苷类分离的常用色谱材料，多用氯仿-甲醇或氯仿-甲醇-水系统洗脱。但硅胶对苷类物质的分离效果远不如其对脂溶性物质的分离，往往用于初步分离或部位分离。反相硅胶常用于苷类的分离，常用的反相色谱材料有Rp-18和Rp-8。反相硅胶分离苷类物质效果很好，是目前分离苷类物质较好的色谱材料，常用的洗脱剂是水-甲醇系统和水-乙腈系统等。分离苷类物质所用的葡聚糖凝胶主要是可在有机相适用的类型，如SephedexLH-20，对水溶性很大的苷类物质，也可用水相使用的是Sephedex-G系列葡聚糖凝胶。常用的洗脱剂一般是逐渐增加醇浓度的水-醇溶剂系统。

（二）醌类化合物的提取与分离

1．醌类化合物的提取方法

（1）有机溶剂提取法。

游离醌类的极性较小，可用极性较小的有机溶剂提取。苷类极性较苷元大，故可用甲醇、乙醇和水提取。实际工作中，一般常选甲醇或乙醇作为提取溶剂，可以把不同类型、不同存在状态、性质各异的醌类成分都提取出来，所得的总醌类提取物可进一步纯化与分离。

（2）碱提酸沉法。

用于提取具有游离酚羟基的醌类化合物。酚羟基与碱成盐而溶于碱水溶液中，酸化后酚羟基游离而沉淀析出。

（3）水蒸气蒸馏法。

适用于分子量小、有挥发性的苯醌及萘醌类化合物。

2．醌类化合物的分离

（1）蒽醌苷类与游离蒽醌的分离。

蒽醌苷类与游离蒽醌衍生物的极性差别较大，故在有机溶剂中的溶解度不同。如苷类在氯仿中不溶，而游离者则溶于氯仿，可据此进行分离。但应当注意一般羟基蒽醌类衍生物及其相应的苷类在植物体内多通过酚羟基或羧基结合成镁、钾、钠、钙盐形式存在，为充分提取出蒽醌类衍生物，必须预先加酸酸化使之全部游离后再进行提取。同理在用氯仿等极性较小的有机溶剂从水溶液中萃取游离蒽醌衍生物时也必须使之处于游离状态，才能达到分离苷或游离蒽醌的目的。

（2）游离蒽醌的分离。

1）pH梯度萃取法。采用pH梯度萃取法是分离游离蒽醌的常用方法。

2）色谱法。色谱法是系统分离羟基蒽醌类化合物的有效手段，当药材中含有一系列结构相近的蒽醌衍生物时，常需经过色谱法才能得到满意的分离。

分离游离羟基蒽醌衍生物时常用的吸附剂主要是硅胶，一般不用氧化铝，尤其不用碱性氧化铝，以避免与酸性的蒽醌类成分发生不可逆吸附而难以洗脱。另外，游离羟基蒽醌衍生物含有酚羟基，故有时也可采用聚酰胺色谱法。

（3）蒽醌苷类的分离。

蒽醌苷类因其分子中含有糖，故极性较大，水溶性较强，分离和纯化都比较困难，主要应用色谱方法。在进行色谱分离之前，往往采用溶剂法处理粗提物，除去大部分杂质，制得较纯的总苷后再进行层析分离。

溶剂法在用溶剂法纯化总蒽醌苷提取物时，一般常用乙酸乙酯、正丁醇等极性较大的有机溶剂，将蒽醌苷类从水溶液中提取出来，使其与水溶性杂质相互分离。

色谱法是分离蒽醌苷类化合物最有效的方法，过去主要应用硅胶柱色谱。近年来葡聚糖凝胶柱色谱和反相硅胶柱色谱得到普遍应用，使极性较大的蒽醌苷类化合物得到有效分离。应用葡聚糖凝胶柱色谱分离蒽醌苷类成分主要依据分子大小的不同，例如大黄蒽醌苷类的分离：将大黄的70%（V/V）甲醇提取液加到Sephadex LH-20凝胶柱上，并用70%（V/V）甲醇洗脱，分段收集，依次先后得到二蒽酮苷（番泻苷B,A,D,C）、蒽醌二葡萄糖苷、蒽醌单糖苷、游离苷元。

（三）简单苯丙素类、香豆素的提取与分离

1．简单苯丙素类的提取

简单苯丙素类成分依其极性大小和溶解性的不同，一般用有机溶剂或水提取，按照中药化学成分分离的一般方法分离，如硅胶柱色谱、高效液相色谱等。其中苯丙烯、苯丙醛及苯丙酸的简单酯类衍生物多具有挥发性，是挥发油芳香族化合物的主要组成部分，可用水蒸气蒸馏法提取。苯丙酸衍生物是植物酸性成分，可用有机酸的常规方法提取。

2．香豆素类的提取

香豆素类成分多以亲脂性的游离形式存在于植物中，可以用一般的有机溶剂，如乙醚、氯仿、丙酮等提取，而香豆素苷类因极性增大而具亲水性，可选亲水性溶剂，如甲醇、乙醇或水提取。此外，香豆素类成分具有内酯结构，亦可用碱溶酸沉法提取；部分小分子香豆素类成分具有挥发性，可用水蒸气蒸馏法提取。

（1）溶剂提取法。

香豆素类成分可用各种溶剂提取，如甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等。其提取方法可采用乙醚等溶剂先提取脂溶性成分，再用甲醇（乙醇）或水提取大极性部分。也可先用甲醇（乙醇）或水提取，再用溶剂或大孔吸附树脂法划分为脂溶性部位和水溶性部位。溶剂提取法是香豆素类成分提取的主要方法。

如从前胡中提取香豆素类成分，是先用乙醇回流提取，回收溶剂得醇浸膏。醇浸膏分散在水中，先以乙酸乙酯萃取得到脂溶性部分，再以正丁醇萃取得到香豆素苷类。

（2）碱溶酸沉法。

用溶剂法提取香豆素类成分，常有大量中性杂质存在，可利用香豆素类具有内酯结构，能溶于稀碱液而和其他中性成分分离，碱溶液酸化后内酯环合，香豆素类成分即可游离析出，也可用乙醚等有机溶剂萃取得到。

因香豆素类的开环产物顺式邻羟基桂皮酸在碱液中长时间加热会异构为反式邻羟基桂皮酸，故碱溶酸沉法必须严格控制在比较温和的条件下进行。此外，一些对酸碱敏感的香豆素类成分不能用碱溶酸沉法提取，如8位具有酰基则碱开环后不能酸化闭环；具有侧链酯基的酯基会碱水解；具有烯丙醚或邻二醇结构的会在酸作用下水解或结构重排。

（3）水蒸气蒸馏法。

小分子的香豆素类成分因具有挥发性，可采用水蒸气蒸馏法提取，但本法适应面窄，且受热温度高而时间长，有时有可能引起结构的变化，现已少用。

3．香豆素类的分离

中药中的香豆素类成分往往是结构类似、极性相近的一种或几种小类型的香豆素类化合物共同存在，用常规的溶剂法、结晶法难以相互分离，一般应用色谱法进行分离纯化。常用的色谱分离方法有柱色谱、制备薄层色谱和高效液相色谱。

柱色谱分离一般采用硅胶为吸附剂，洗脱剂可先用薄层色谱试验筛选，常用的洗脱系统可用环己烷（石油醚）-乙酸乙酯、环己烷（石油醚）-丙酮、氯仿-丙酮等。氧化铝一般不用于香豆素类成分的柱色谱分离。香豆素苷类的分离可用反相硅胶（Rp-18,Rp-8等）柱色谱，常用的洗脱系统可用水-甲醇、甲醇-氯仿。此外，葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱等也可用于香豆素类成分的分离。

近年来，高效液相色谱用于分离香豆素类成分已经较为普遍，尤其是对极性很小的多酯基香豆素类、极性较强的香豆素苷类分离效果好。对小极性香豆素类，一般用正相色谱（Si-60等）或反相色谱，而对香豆素苷类，一般用反相色谱（Rp-18,Rp-8等）。因为香豆素类成分在薄层色谱上很容易以荧光定位斑点，故制备薄层色谱也可用于香豆素类成分的分离，极性小的香豆素类可用环己烷（石油醚）-乙酸乙酯系统，极性较大的香豆素类可用氯仿-甲醇系统。

（四）黄酮类化合物的提取与分离

黄酮类化合物的提取，主要是根据被提取物的性质及伴存的杂质来选择适合的提取溶剂。大多数游离的黄酮类化合物宜用极性较小的溶剂，如用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等提取，而对多甲氧基黄酮，甚至可用苯进行提取。黄酮苷类以及极性较大的游离黄酮（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些极性较大的混合溶剂如甲醇（乙醇）-水（1∶1）进行提取。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花色素类化合物时，可加入少量酸（如质量百分数0.1%盐酸）。但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应，为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，也常按一般提取苷的方法预先破坏酶的活性。

1．乙醇或甲醇提取法

乙醇或甲醇是最常用的提取黄酮类化合物的溶剂，高浓度的醇（如90%～95%，V/V）适用于提取游离黄酮，60%（V/V）左右浓度的醇适于提取黄酮苷类。提取方法包括冷浸法、渗漉法和回流法等。例如葛根总黄酮的提取采用95%（V/V）乙醇或甲醇冷浸法；橙皮苷的提取采用50%（V/V）或60%（V/V）的乙醇渗漉法；银杏叶总黄酮的提取方法为70%（V/V）乙醇回流提取，收率大大高于水煎法。

2．热水提取法

热水仅限于提取黄酮苷类。此方法成本低、安全，适合于工业化生产。但是，热水提取出的杂质较多。在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素。

3．碱性水或碱性稀醇提取法

由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水（如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液）或碱性稀醇（如体积比50%的乙醇）浸出，浸出液经酸化后可使黄酮类化合物游离，或沉淀析出，或用有机溶剂萃取。常用的碱性水溶液为稀氢氧化钠溶液和石灰水。稀氢氧化钠水溶液浸出能力较大，但浸出杂质较多，如将其浸出液酸化，迅速滤去（如在0.5 h内滤去）先析出的沉淀物（多半是杂质），滤液中再析出的沉淀物可能是较纯的黄酮类化合物。石灰水（氢氧化钙水溶液）的优点是使含有多羟基的鞣质，或含有羧基的果胶、黏液质等水溶性杂质生成钙盐沉淀，不被溶出，有利于浸出液的纯化，例如从槐米（Sophora japonica）中提取芦丁。但其缺点是浸出效果可能不如稀氢氧化钠水溶液，且有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出。5%（V/V）氢氧化钠稀乙醇液浸出效果较好，但浸出液酸化后，析出的黄酮类化合物在稀醇中有一定的溶解度，故可能降低产品的收率。

用碱性溶剂提取时，应当注意所用的碱浓度不宜过高，以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当分子中有邻二酚羟基时，可加硼酸保护。

4．黄酮类化合物的分离

黄酮类化合物的分离包括黄酮类化合物与非黄酮类化合物的分离，以及黄酮类化合物中各单体的分离。黄酮类化合物的分离主要根据其极性差异、酸性强弱、分子量大小和有无特殊结构等，采用适宜的分离方法。黄酮类化合物的分离方法虽然很多，但单体的分离仍主要依靠各种色谱法。

（1）溶剂萃取法。

用水或不同浓度的醇提取得到的浸出物成分复杂，往往不能直接析出黄酮类化合物，需尽量蒸去溶剂，使成糖浆状或浓水液。然后用不同极性的溶剂进行萃取，可能使游离黄酮与黄酮苷分离或使极性较大与极性较小的黄酮分离。例如先用乙醚自水溶液中萃取游离黄酮，再用乙酸乙酯反复萃取得到黄酮苷。得到的乙醚或乙酸乙酯组分，可进一步用重结晶法进行分离，有时可得到单体化合物，也可用其他方法继续分离。利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取也可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。

（2）pH梯度萃取法。

pH梯度萃取法适用于酸性强弱不同的游离黄酮类化合物的分离。根据黄酮类化合物酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用5%NaHCO3可萃取出7，4′-二羟基黄酮、5%NaCO3可萃取出7-或4′-羟基黄酮、0.2%NaOH可萃取出具有一般酚羟基的黄酮、4%NaOH可萃取出5-羟基黄酮（以上浓度均为体积百分比），从而达到分离的目的。

（3）柱色谱法。

柱色谱的填充剂有硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖凝胶和纤维素粉等，其中以硅胶、聚酰胺最常用。

1）硅胶柱色谱。此法应用范围较广，主要适宜分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及黄酮苷类等。在用硅胶柱分离游离黄酮时，一般选择有机溶剂为洗脱剂，如不同比例的氯仿-甲醇混合溶剂等；分离黄酮苷时常用含水的溶剂系统洗脱。

2）聚酰胺柱色谱。聚酰胺对各种黄酮类化合物（包括黄酮苷和游离黄酮）有较好的分离效果，且其容量比较大，适合于制备性分离。聚酰胺色谱的分离机制，一般认为是“氢键吸附”，即聚酰胺的吸附作用是通过其酰胺羰基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生的，其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中酚羟基的数目与位置等及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合的能力越强，则聚酰胺对黄酮类化合物的吸附作用将越弱。

3）氧化铝柱色谱。氧化铝对黄酮类化合物吸附力强，特别是具有3-羟基或5-羟基、4-羰基及邻二酚羟基结构的黄酮类化合物与铝离子络合而被牢固地吸附在氧化铝柱上，难以洗脱，所以很少应用。但是当黄酮类化合物分子中没有上述结构，或虽有上述结构但羟基已被甲基化或苷化时，也可用氧化铝柱分离。

4）葡聚糖凝胶柱色谱。Sephadex G型及Sephadex LH-20型凝胶常用于黄酮类化合物的分离。其分离原理是：分离游离黄酮时，主要靠吸附作用，因吸附力的强弱不同而分离，一般黄酮类化合物的酚羟基数目越多，与凝胶的吸附强度越大，越难洗脱。分离黄酮苷时，主要靠分子筛作用，黄酮苷的分子量越大，越容易被洗脱。

葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有：①碱性水溶液（如0.1 mol/L NH3·H2O），含盐水溶液（0.5 mol/L NaCl）等。②醇及含水醇，如甲醇、甲醇-水（不同比例）、叔丁醇-甲醇（3∶1）、乙醇等。③其他溶剂：如含水丙酮、甲醇-氯仿等。

（4）高效液相色谱法。

高效液相色谱法对各类黄酮化合物均可获得良好的分离效果。由于黄酮类化合物大多具有多个羟基，黄酮苷含有糖基，花色素类为离子型化合物，故用高效液相色谱分离时，往往采用反相柱色谱，常用的洗脱剂为含有一定比例的甲酸或乙酸的水-甲醇溶剂系统或水-乙腈溶剂系统。

（五）萜类化合物的提取与分离

萜类化合物种类繁杂、数量庞大，理化性质差异较大，而且同分异构体多，结构稳定性差，所以提取分离难度相对较大。一般多根据此类成分挥发性、亲脂亲水性、特殊官能团的专属反应性以及极性等差异进行提取分离。如前所述，提取分离萜类化合物要注意减少或避免光、热、酸及碱对结构的影响。

1．萜类化合物的提取

除可用提挥发油的方法提取挥发性萜外，还可用甲醇或乙醇提取，醇提取液根据需要，浓缩至一定体积，并调整适当的醇浓度，再用不同极性的亲脂性有机溶剂按极性由小到大的递增顺序依次萃取，得到不同脂溶性的萜类提取物。对从富含油脂及叶绿素的中药材提得的醇提物，可将醇浓缩液的含醇量调至70％～80％（V/V），用石油醚萃取去除强亲脂性杂质后，再选用一定的亲脂性有机溶剂萃取总萜；若药材含极性较大的萜类（如多羟基萜内酯），则可先用石油醚对药材脱脂后，再用醇提取。萜内酯的提取可结合其结构特点进行。先用提取萜的方法提取出含萜内酯的粗总萜，然后利用内酯在热碱溶液中易开环成盐溶于水，酸化环合又可析出原内酯的特性，用碱水提取酸化沉淀的方法处理粗总萜，可得到较纯的总萜内酯（倍半萜内酯用此法较多）。但某些对酸碱易引起结构发生不可逆变化的萜内酯，不可用碱溶酸沉法纯化。萜内酯的纯化也可用硅胶或氧化铝柱色谱法进行，一般多采用硅胶作固定相。以石油醚及石油醚混合不同比例的乙醚洗脱，据报道，萜内酯多集中在石油醚-乙醚（1∶1）的洗脱流分中。

提取萜苷类多用甲醇或乙醇作溶剂，也可用水、稀丙酮及乙酸乙酯，提取液经减压浓缩后加水溶解，滤去水不溶性杂质，用乙醚、氯仿或石油醚萃取去除脂溶性杂质，脱脂后的萜苷水溶液可采用下述方法去除水溶性杂质：①正丁醇萃取法。萜苷水液以正丁醇萃取，正丁醇萃取液经减压浓缩，可得到粗总萜苷。②活性炭、大孔树脂吸附法。用活性炭或大孔树脂吸附水溶液中萜苷后，先用水及稀乙醇依次洗脱除去水溶性杂质，再用合适浓度的乙醇洗脱萜苷。在萜苷的提取纯化过程中，要防止酶及酸对苷键的裂解，尤其是环烯醚萜苷稳定性差，更需注意。

2．萜类化合物的分离

（1）利用特殊官能团分离。

萜类化合物中常见的官能团为双键、羰基、内酯环、羧基、碱性氮原子（萜类生物碱）及羟基等，可有针对性地用加成、碱开环酸环合、酸碱成盐及形成酸性酯等反应，使具有相应官能团萜的溶解性发生改变，以固体析出或液体转溶的形式从总萜中分离（具体方法在挥发油的分离中介绍）。双键是萜类多具有的官能团，其加成物可使液态单萜烯以结晶形式析出，具有一定的分离精制意义。

（2）结晶法分离。

有些萜类化合物的粗提物，用其他溶剂渗提或萃取法纯化处理后，其纯度会明显升高，若将其提取液适当浓缩，常会析出粗晶（有的提取物不经浓缩即可析晶），滤取此结晶，再用适当溶剂或方法重结晶，有时可得到纯度很高的结晶。如薄荷醇、樟脑可用结晶法分离。

（3）柱色谱法分离。

柱色谱法是分离萜类化合物的主要方法，许多用其他方法难以分离的萜类异构体都可用吸附柱色谱法分离。常用的吸附剂为硅胶、中性氧化铝（非中性氧化铝易引起萜类化合物结构变化）及硅酸，其中硅胶应用最广。常用的洗脱剂多以石油醚、正己烷、环己烷及苯单一溶剂分离萜烯，或混以不同比例的乙酸乙酯或乙醚分离含氧萜，对于多羟基的萜醇及萜酸还要加入甲醇或用氯仿-乙醇洗脱。

对于单纯以硅胶或氧化铝为吸附剂难以分离的萜类化合物，可用硝酸银络合柱色谱分离。一般多以硝酸银-硅胶或硝酸银-氧化铝作吸附剂进行络合吸附。其分离机制主要是利用硝酸银可与双键形成π络合物，而双键数目、位置及立体构型不同的萜在络合程度及络合物稳定性方面有一定的差异，利用此差异可进行色谱分离。硝酸银络合色谱分离萜类化合物的洗脱剂与上述硅胶及氧化铝色谱相同。

3．挥发油的提取

（1）蒸馏法。

该法是提取挥发油最常用的方法，一般将中药适当切碎后加水浸泡，然后可用共水蒸馏、隔水蒸馏或水蒸气蒸馏法提取。前两种方法虽简单，但油受热温度较高，易引起药材焦化，及某些成分的分解；后一种方法提油，温度相对较低，但设备较前两种方法略复杂。馏出液若油水不分层，可采用盐析法促使挥发油自水中析出，或将初次蒸馏液重新蒸馏，再盐析后用低沸点有机溶剂如乙醚、石油醚萃取挥发油。

蒸馏法虽具有设备简单、容易操作、成本低、提油率高等优点，但总体来说，挥发油与水接触时间较长，温度较高，某些含有对热不稳定成分的挥发油容易产生相应成分的分解而影响挥发油的品质，因此对热不稳定的挥发油不能用此法提取。

（2）溶剂提取法。

含挥发油的药材用低沸点有机溶剂连续回流提取或冷浸，常用的有机溶剂有戊烷、石油醚（30～60℃）、二硫化碳、四氯化碳等。提取液经蒸馏或减压蒸馏除去溶剂，即可得到粗制挥发油。此法得到的挥发油含杂质较多，因为其他脂溶性成分如树脂、油脂、蜡、叶绿素等也同时被提出，故必须进一步精制提纯。其方法是将挥发油粗品加适量的浓乙醇浸渍，放置冷冻（一般在-20℃左右），滤除析出物后，再蒸馏除去乙醇；也可将挥发油粗品再进行蒸馏，以获得较纯的挥发油。

（3）吸收法。

油脂类一般具有吸收挥发油的性质，往往利用此性质提取贵重的挥发油，如玫瑰油、茉莉花油常采用吸收法进行。通常用无臭味的猪油3份与牛油2份的混合物，均匀地涂在面积为50 cm×100 cm的玻璃板两面，然后将此玻璃板嵌入高5～10 cm的木制框架中，在玻璃板上面铺放金属网，网上放一层新鲜花瓣，这样一个个的木框玻璃板重叠起来，花瓣被包围在两层脂肪的中间，挥发油逐渐被油脂所吸收，待脂肪充分吸收芳香成分后，刮下脂肪，即为“香脂”，谓之冷吸收法。或者将花等原料浸泡于油脂中，于50～60℃条件下低温加热，让芳香成分溶于油脂中，此则为温浸吸收法。吸收挥发油后的油脂可直接供香料工业用，也可加入无水乙醇共搅，醇溶液减压蒸去乙醇即得精油。

（4）压榨法。

此法适用于含挥发油较多的原料，如鲜橘、柑、柠檬的果皮等，一般药材经撕裂粉碎压榨（最好是在冷却条件下），将挥发油从植物组织中挤压出来，然后静置分层或用离心机分出油，即得粗品。此法所得的产品不纯，可能含有水分、叶绿素、黏液质及细胞组织等杂质而呈浑浊状态，同时也很难将挥发油全部压榨出来，故可再将压榨后的残渣进行水蒸气蒸馏，使挥发油提取完全。压榨法所得的挥发油可保持原有的新鲜香味。

（5）二氧化碳超临界流体提取法。

二氧化碳超临界流体应用于提取芳香挥发油，具有防止氧化热解及提高品质的突出优点。例如紫苏中特有香味成分紫苏醛，紫丁香花中具有独特香味成分，均不稳定易受热分解，用水蒸气蒸馏法提取时受到破坏，香味大减，采用二氧化碳超临界流体提取所得芳香挥发油气味和原料相同，明显优于其他方法。在橘皮油、柠檬油、桂花油、香兰素的提取上，应用此法提取均获得较好效果。

4．挥发油的分离

用前述方法从植物中提取出来的挥发油往往为混合物，需经分离精制后，方可获得单体化合物，常用分离方法如下：

（1）分馏法。挥发油的组成成分由于类别不同，它们的沸点也有差别，如萜类成分中的各类碳原子一般相差5个，还有双键的数目、位置和含氧官能团的不同，它们的沸点有一定的差距，而且还有一定的规律性，在单萜中沸点随着双键的增多而升高，即三烯>二烯>一烯。含氧单萜的沸点随着官能团的极性增大而升高，即醚<酮<醛<醇<酸。但酯比相应的醇沸点高。

（2）冷冻析晶法。将挥发油于0℃以下放置使析出结晶，若无结晶析出可将温度降至-20℃，继续放置至结晶析出，再经重结晶可得单体结晶。如薄荷油冷至-10℃，经12 h析出第一批粗脑，油再在-20℃冷冻24 h可析出第二批粗脑，粗脑加热熔融，在0℃冷冻即可得较纯薄荷脑。本法操作简单，但对某些挥发性单体分离不够完全，而且大部分挥发油冷冻后仍不能析出结晶。挥发油中的某些成分在接近其沸点温度时，往往被破坏，故通常都采用减压分馏。一般在35～70℃/1333.22 Pa被蒸馏出来的是单萜烯类化合物；在70～100℃/1 333.22 Pa蒸馏出来的是单萜含氧化合物；而在80～110℃/1333.22 Pa被蒸馏出来的则是倍半萜烯及含氧化合物，有时倍半萜含氧物沸点很高。因为所得的各馏分中的组成成分常呈交叉情况。经过分馏所得的每一馏分仍可能是混合物，所以需再进一步精馏或结合冷冻、重结晶、色谱等方法，可得到单一成分。

（3）化学分离法。

1）碱性成分的分离。分离挥发油中的碱性成分时，可将挥发油溶于乙醚，加1％（V/V）硫酸或盐酸萃取，分取的酸水层碱化，用乙醚萃取，蒸去乙醚即可得到碱性成分。

2）酚、酸性成分的分离。先用5％（V/V）的碳酸氢钠溶液直接进行萃取，分出碱水层后加稀酸酸化，乙醚萃取，蒸去乙醚可得酸性成分。提取酸性成分后的挥发油再用2％（V/V）氢氧化钠萃取，分取碱水层，酸化，乙醚萃取，蒸去乙醚可得酚类或其他弱酸性成分。

3）醇类成分的分离。将挥发油与丙二酸单酰氯或邻苯二甲酸酐或丙二酸反应生成酸性单酯，再将生成物转溶于碳酸氢钠溶液中，用乙醚洗去未作用的挥发油，将碱溶液酸化，再用乙醚提取所生成的酯，蒸去乙醚，残留物经皂化，分得原有的醇类成分。伯醇容易形成酯，仲醇反应较慢，而叔醇则较难作用。

4）醛、酮成分的分离。除去酚、酸类成分的挥发油母液，经水洗至中性，以无水硫酸钠干燥后，加亚硫酸氢钠饱和液振摇，分出水层或加成物结晶，加酸或碱液处理，使加成物分解，以乙醚萃取，可得醛或酮类化合物。也可将挥发油与吉拉德试剂T或P回流1 h，使生成水溶性的缩合物，用乙醚除去不具羰基的组分，再以酸处理，也可获得羰基化合物。

5）其他成分的分离。挥发油中的酯类成分，多使用精馏或色谱分离，萜醚成分在挥发油中不多见，可利用醚类与浓酸形成盐易于结晶的性质从挥发油中分离出来，如桉叶油中的桉油精属于萜醚成分，它与浓磷酸可形成白色的磷酸盐结晶。或利用溴、氯化氢、溴化氢、亚硝酰氯等试剂与双键加成，这种加成产物常为结晶状态，可借以分离和纯化。

（4）色谱分离法。挥发油经用前述方法分离，多数难以得到单体化合物，而将分馏法或化学法与色谱法相结合往往能收到较好的分离效果。以吸附柱色谱分离挥发油，应用最广泛的吸附剂是硅胶和氧化铝，洗脱剂多用石油醚或己烷，混以不同比例的乙酸乙酯组成，经粗分处理后的挥发油，以石油醚或己烷等溶剂溶解后上柱，一般多可分离得到单体化合物。如香叶醇和柠檬烯常常共存于许多植物的挥发油中，将此挥发油溶于石油醚，上氧化铝吸附柱，石油醚洗脱，极性小的柠檬烯先被石油醚洗脱下来，再在石油醚中加入少量甲醇洗脱，极性较大的香叶醇被洗脱下来。

对采用上述色谱条件难以分离的挥发油，可用硝酸银-硅胶或硝酸银-氧化铝柱色谱及薄层色谱分离，一般硝酸银的加入量为2%～25%（W/W）。对于特别难分离的挥发油可用制备薄层色谱进行分离，其展开方式可用连续二次展层及不同展开剂单向二次展层，以获得较好的分离效果。气相色谱是研究挥发油组成成分的非常有效的方法，近年来，应用制备性气-液色谱，成功地将挥发油中许多成分分开并予以鉴定。

（六）三萜类化合物的提取

1．醇类溶剂提取法

本法为目前提取皂苷的常用方法，提取流程如下图1-3-5：

2．酸水解有机溶剂萃取法

将植物原料在酸性溶液中加热水解，过滤，药渣水洗后干燥，然后用有机溶剂提取出皂苷元。也可先用醇类溶剂提取出皂苷，然后加酸水解，滤出水解物，再用有机溶剂提取出皂苷元。

3．碱水提取法

某些皂苷含有羧基，可溶于碱水，因此可用碱溶酸析法提取。

4．三萜类化合物的分离

（1）分段沉淀法。由于皂苷难溶于乙醚、丙酮等溶剂，故可利用此性质，将粗皂苷先溶于少量甲醇或乙醇中，然后逐滴加入乙醚、丙酮或乙醚∶丙酮（1∶1）的混合溶剂（加入量以能使皂苷从醇溶液中析出为限），边加边摇匀，皂苷即可析出。开始析出的沉淀往往含杂质较多，滤出后，继续加入乙醚可得到纯度较高的皂苷。也可采用分段沉淀法，逐渐降低溶剂极性，极性不同的皂苷就可分批沉出，从而达到分离的目的。分段沉淀法虽然简便，但难以分离完全，不易获得纯品。

（2）胆固醇沉淀法。皂苷可与胆固醇生成难溶性的分子复合物，但三萜皂苷与胆固醇形成的复合物不如甾体皂苷与胆固醇形成的复合物稳定。此性质曾被用于皂苷的分离，即先将粗皂苷溶于少量乙醇中，再加入胆固醇的饱和乙醇溶液，至不再析出沉淀为止（混合后需稍加热），滤过，取沉淀用水、醇、乙醚顺次洗涤以除去糖类、色素、油脂和游离的胆固醇。然后将此沉淀干燥后，用乙醚回流提取，胆固醇被乙醚提出，使皂苷解脱下来，残留物即为较纯的皂苷。

（3）色谱分离法。

由于中药中的三萜类成分常与其他极性相近的杂质共存，且有些三萜类化合物间结构差别不大，因此用上述分离方法获得单体较为困难。色谱法是目前分离三萜类化合物常用的方法。

1）吸附柱色谱法。此法可用于分离各类三萜化合物。吸附柱色谱依所用的吸附剂性质的不同，分为正相吸附柱色谱和反相吸附柱色谱。正相吸附柱色谱的吸附剂常用硅胶，样品上柱后，可用不同比例的混合溶剂如氯仿-丙酮、氯仿-甲醇或氯仿-甲醇-水等进行梯度洗脱。反相柱色谱通常以反相键合相硅胶Rp-18,Rp-8或Rp-2为填充剂，常用甲醇-水或乙腈-水等溶剂为洗脱剂。反相色谱柱需用相对应的反相薄层色谱进行检识，如使用预制的Rp-18,Rp-8等反相高效薄层板。制备薄层色谱用于皂苷的分离，也可取得较好效果。

2）分配柱色谱法。由于皂苷极性较大，故也可采用分配色谱法进行分离，常用硅胶等作为支持剂，固定相为3％草酸水溶液等，流动相为含水的混合有机溶剂，如氯仿-甲醇-水、二氯甲烷-甲醇-水、乙酸乙酯-乙醇-水等，也可用水饱和的正丁醇等作为流动相。

3）高效液相色谱法。高效液相色谱法是目前分离皂苷类化合物最常用的方法，其分离效能较高。用于皂苷的分离制备一般采用反相色谱柱，以甲醇-水、乙腈-水等系统为洗脱剂。

4）大孔树脂柱色谱。大孔树脂色谱是近年来常用于分离极性较大的化合物的一种方法，尤其适用于皂苷的精制和初步分离。将含有皂苷的水溶液通过大孔树脂柱后，先用水洗涤除去糖和其他水溶性杂质，然后再用不同浓度的甲醇或乙醇依其浓度由低到高的顺序进行梯度洗脱。极性大的皂苷，可被10％～30％（V/V）的甲醇或乙醇洗脱下来，极性小的皂苷，则被50％（V/V）以上的甲醇或乙醇洗脱下来。

5）凝胶色谱法。凝胶色谱法是利用分子筛的原理来分离分子量不同的化合物，在用不同浓度的甲醇、乙醇或水等溶剂洗脱时，各成分按分子量递减顺序依次被洗脱下来，即分子量大的皂苷先被洗脱下来，分子量小的皂苷后被洗脱下来。应用较多的是能在有机相使用的Sephadex LH-20。

用色谱法分离三萜类化合物通常采用多种色谱法相组合的方法，即一般先通过硅胶柱色谱进行分离后，再结合低压或中压柱色谱、薄层制备色谱、高效液相色谱或凝胶色谱等方法进行进一步的分离。对皂苷的分离，还可在进行硅胶柱色谱前，先用大孔树脂柱色谱进行精制或初步分离。

（七）强心苷的提取与分离

从中药中分离提纯强心苷是比较复杂与困难的，因为它在植物中的含量一般都比较低（质量百分比1%以下）；同一植物又常含几个甚至几十个结构相似、性质相近的强心苷，且常与糖类、皂苷、色素、鞣质等共存，这些成分往往能影响或改变强心苷在许多溶剂中的溶解度；多数强心苷是多糖苷，受植物中酶、酸的影响可生成次生苷，与原生苷共存，从而增加了成分的复杂性和提取分离工作的难度。

由于强心苷易受酸、碱和酶的作用，发生水解、脱水及异构化等反应，因此，在提取分离过程中要特别注意这些因素的影响或应用。在研究或生产中，当以提取分离原生苷为目的时，首先要注意抑制酶的活性，防止酶解，原料要新鲜，采收后尽快干燥，最好在50～60℃通风快速烘干或晒干，保存期间要注意防潮，控制含水量，提取时要避免酸碱的影响；当以提取次生苷为目的时，要注意利用上述的影响因素，采取诸如发酵以促进酶解，部分酸、碱水解等适当方法，以提高目标提取物的产量。

1．强心苷的提取

强心苷的原生苷和次生苷，在溶解性上有亲水性、弱亲脂性、亲脂性之分，但均能溶于甲醇、乙醇中。一般常用甲醇或70%～80%（V/V）乙醇作溶剂，提取效率高，且能使酶失去活性。原料为种子或含脂类杂质较多时，需用石油醚或汽油脱脂后提取；原料为含叶绿素较多的叶或全草时，可用稀碱液皂化法或将醇提液浓缩，保留适量浓度的醇，放置，使叶绿素等脂溶性杂质成胶状沉淀析出，滤过除去。强心苷稀醇提取液经活性炭吸附也可除去叶绿素等脂溶性杂质。用氧化铝柱或聚酰胺柱吸附，可除去糖、水溶性色素、鞣质、皂苷、酸性及酚性物质。但应注意，强心苷亦有可能被吸附而损失。经初步除杂质后的强心苷浓缩液，可用氯仿和不同比例的氯仿-甲醇（乙醇）溶液依次萃取，将强心苷按极性大小划分为亲脂性、弱亲脂性等几个部分，供进一步分离。

2．强心苷的分离

分离混合强心苷，常采用溶剂萃取法、逆流分溶法和色谱分离法。对含量较高的组分，可用适当的溶剂，反复结晶得到单体。但一般需用多种方法配合使用。两相溶剂萃取法和逆流分溶法均是利用强心苷在两相溶剂中分配系数的差异而达到分离目的。前者的应用实例如毛花洋地黄苷甲、乙、丙的分离。后者的应用实例如黄夹苷甲、乙的分离。

分离亲脂性单糖苷、次生苷和苷元，一般选用吸附色谱，常以中性氧化铝、硅胶为吸附剂，用正己烷-乙酸乙酯、苯、丙酮、氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇等作洗脱剂。对弱亲脂性的成分宜选用分配色谱，可用硅胶、硅藻土、纤维素为支持剂，以乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水作洗脱剂。

（八）甾体皂苷的提取与分离

甾体皂苷的提取分离方法基本与三萜皂苷相似，只是甾体皂苷一般不含羧基，呈中性，亲水性相对较弱，在提取分离时应加以注意。

1．甾体皂苷的提取

提取皂苷多利用皂苷的溶解性，采用溶剂法提取。主要使用甲醇或稀乙醇作溶剂，提取液回收溶剂后，用丙酮、乙醚沉淀或加水后用水饱和正丁醇萃取，或用大孔树脂处理等方法，得到粗皂苷。

提取皂苷元可根据其难溶或不溶于水，易溶于有机溶剂的性质，以有机溶剂进行萃取。此外，实验室中常自原料中先提取粗皂苷，将粗皂苷加酸加热水解，然后用苯、氯仿等有机溶剂自水解液中提取皂苷元。工业生产常将植物原料直接在酸性溶液中加热水解，水解物水洗干燥后，再用有机溶剂提取。

2．甾体皂苷的分离

分离混合甾体皂苷的方法与三萜皂苷相似，常采用溶剂沉淀法（乙醚、丙酮）、胆固醇沉淀法、吉拉德试剂法（含羰基的甾体皂苷元）、硅胶柱色谱法（洗脱剂多采用CHCl3-MeOH-H2O系统）、大孔吸附树脂柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱及液滴逆流色谱（DCCC）等方法进行分离。有时对正丁醇部位极性较大的皂苷成分在上述分离的基础上，尚需用反相中低压Lobar柱色谱、反相制备HPLC或制备TLC等手段分离。例如，从新鲜大蒜（Allium satyvum）鳞茎的水溶性部位中分得的呋甾皂苷protoisoeruboside-B（Ⅰ）和螺甾皂苷eruboside-B（Ⅱ）,isoeruboside-B（Ⅲ）3个甾体皂苷。其中protoisoeruboside-B有显著的提高纤溶活性，isoeruboside-B有明显的延长血液凝固时间和提高纤溶活性。

（九）总生物碱的提取

1．水或酸水提取法

具有一定碱性的生物碱在植物体内都以盐的形式存在，故可选用水或酸水提取。常用无机酸水提取，以便将生物碱有机酸盐置换成无机酸盐，增大溶解度。

酸水提取法常用0.1%～1%的硫酸、盐酸或醋酸、酒石酸溶液作为提取溶剂，采用浸渍法或渗漉法提取。个别含淀粉少者可用煎煮法。酸水提取的优点是使生物碱的大分子有机酸盐变为小分子无机酸盐，增大在水中的溶解度，且提取方法比较简便。但此法的主要缺点是提取液体积较大，浓缩困难，而且水溶性杂质多。故用酸水提取后，一般可采用下列纯化和富集生物碱的方法：

（1）阳离子树脂交换法。

生物碱盐在水中可解离出生物碱阳离子，能和阳离子交换树脂发生离子交换反应，被交换到树脂上。操作时将总碱的酸水液通过强酸型阳离子交换树脂柱，使酸水中生物碱阳离子与树脂上的阳离子进行交换，用生物碱沉淀反应检查交换是否完全。交换完全后，用中性水或乙醇洗除柱中的杂质。

生物碱盐酸盐 生物碱阳离子

注：R代表型阳离子交换树脂，B代表游离生物碱。

上述过程完成后，可用下述方法将生物碱从树脂上洗脱。

①碱化后用氯仿或乙醚提取。将已交换上生物碱的树脂从色谱柱中倒出，用氨水碱化至pH为10左右，再用氯仿或乙醚等有机溶剂回流提取，浓缩提取液可得到较纯的总碱。

②碱性乙醇洗脱。用含氨水的乙醇洗脱，中和洗脱液，回收乙醇即得较纯生物碱。

③酸水或酸性乙醇洗脱。交换到树脂上的生物碱阳离子，用酸水或酸性乙醇洗脱时，酸中的阳离子将其置换下来，被吸附在树脂表面，继续用酸水或酸性乙醇洗脱，可得较纯的总碱盐。

（2）萃取法。

将酸水提取液碱化，生物碱游离后，如沉淀，过滤即得；如不沉淀，以适当亲脂性有机溶剂萃取，回收溶剂，即得总生物碱。

2．醇类溶剂提取法

游离生物碱或其盐均可溶于甲醇、乙醇，可用醇回流或渗漉、浸渍。醇提取的优点是对不同碱性生物碱或其盐均可选用，另外水溶性杂质如多糖、蛋白质较少提出。但其缺点是脂溶性杂质多。可配合酸水-碱化-萃取法处理去除。具体方法是醇提取液回收醇后加稀酸水搅拌，放置，滤过，溶液调碱性后以适合的亲脂性有机溶剂萃取，回收溶剂即得总生物碱。

3．亲脂性有机溶剂提取法

大多数游离生物碱都是亲脂性的，故可用氯仿、苯、乙醚以及二氯甲烷等提取游离生物碱。可采用浸渍、回流或连续回流法提取。但一般要将药材用少量碱水湿润后提取，以便使生物碱游离，也可增加溶剂对植物细胞的穿透力。

本提取法的主要优点是水溶性杂质少，按上述工艺流程脂溶性杂质又可经酸水萃取除去。主要缺点为溶剂价格高，安全性差，而且对设备要求严格，以防溶剂泄漏。另外，挥发性生物碱如麻黄碱可用水蒸气蒸馏法提取。可升华的生物碱如咖啡碱可用升华法提取。

4．生物碱的分离

一般来说，一种药材往往含有多种生物碱，提取得到的多是各生物碱的混合物。根据需要，还要将其进一步分离成所需的单体生物碱。

（1）不同类别生物碱的分离。

即将总生物碱按碱性强弱、酚性有无及是否水溶性初步分成五类。一般分离流程如下图1-3-6。

（2）利用生物碱的碱性差异进行分离。

总生物碱中各单体生物碱的碱性往往不同，可用pH梯度萃取法进行分离。具体方法有两种。一种是将总生物碱溶于氯仿等亲脂性有机溶剂，以不同酸性缓冲液依pH由高至低依次萃取，生物碱可按碱性由强至弱先后成盐依次被萃取出而分离，分别碱化后以有机溶剂萃取即可。另一种是将总生物碱溶于酸水，逐步加碱使pH由低至高，每调节一次pH，既用氯仿等有机溶剂萃取，则各单体生物碱依碱性由弱至强先后成盐依次被萃取出而分离。对于碱性有差别的两种生物碱，可采用调pH后简单萃取法分离。如从洋金花的乙醇浸出液中分离莨菪碱和东莨菪碱，就是利用二者碱性差别，将乙醇浸出液浓缩后碱化到pH 9～10，氯仿萃取，氯仿萃取液再用稀酸水萃取，将此酸水液用固体碳酸氢钠碱化后以氯仿萃取，东莨菪碱因碱性小游离而被萃取出。水层再用氨水碱化至pH 10，用氯仿可萃取出碱性大些的莨菪碱。

（3）利用生物碱或生物碱盐溶解度的差异进行分离。

总生物碱中各单体的极性不同，对有机溶剂的溶解度可能有差异，可利用这种差异来分离生物碱。如苦参中苦参碱和氧化苦参碱的分离，可利用苦参总碱中氧化苦参碱极性稍大，难溶于乙醚而苦参碱可溶于乙醚的性质，将苦参总碱溶于氯仿，再加入10倍量以上乙醚，氧化苦参碱即可析出沉淀。从中国粗榧（Cephalotaxus sinensis）的枝叶中用逆流分布法分离三尖杉酯碱（harringtonine）和高三尖杉酯碱（homoharringtonine），也是利用二者极性的微小差异进行分离。分离条件为：固定相，pH 4左右的柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液，流动相为氯仿，二者互相饱和。将总生物碱样品以流动相溶解，进行逆流分布法萃取，三尖杉酯碱主要分布于固定相，高三尖杉酯碱主要分布于流动相。再用Al2O3柱色谱分别进行精制，即可得二者纯品。不同生物碱与不同酸生成的盐溶解性可能不同，也可以利用这种差异来分离生物碱或其盐。如用溶剂法从麻黄中提取分离麻黄碱、伪麻黄碱，即利用二者草酸盐的水溶性不同，提取后经处理得到的甲苯溶液，经草酸溶液萃取后浓缩，草酸麻黄碱溶解度小而析出结晶，草酸伪麻黄碱溶解度大而留在母液中。

（4）利用生物碱特殊官能团进行分离。

有些生物碱的分子中含有酚羟基或羧基，也有少数含内酰胺键或内酯结构。这些基团或结构能发生可逆性化学反应，故可用于分离。酚性生物碱在碱性条件下成盐溶于水，可与一般生物碱分离。如在阿片生物碱中，吗啡具酚羟基而可待因则无酚羟基，用氢氧化钠溶液处理，吗啡成盐溶解而可待因沉淀可将二者分离。

内酯或内酰胺结构的生物碱可在碱性水溶液中加热皂化开环生成溶于水的羧酸盐而与其他生物碱分离，在酸性下又环合成原生物碱而沉淀。如喜树中喜树碱具内酯环，在提取分离喜树碱工艺中，即利用了这一性质。

（5）利用色谱法进行分离。

中药中所含的生物碱往往比较复杂，而且结构相近，用上述分离方法经常不能完全分离，此时需要采用柱色谱法。现将分离生物碱常用的柱色谱方法介绍如下。

1）吸附柱色谱。常用氧化铝或硅胶作为吸附剂，有时也用纤维素、聚酰胺等。以苯、氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂或以其为主的混合溶剂系统作洗脱剂。

2）分配柱色谱。虽然大多数总生物碱能用吸附色谱法分离，但对某些结构特别相近的生物碱，分离效果不一定理想，可采用分配色谱法。如三尖杉中的抗癌生物碱三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的分离，两者结构仅差一个亚甲基，吸附色谱分离效果不佳，而分配色谱能将其分离。具体方法是以硅胶为支持剂，以pH5.0缓冲液为固定相，pH5.0缓冲液饱和的氯仿溶液洗脱，首先洗脱的是高三尖杉酯碱，中间部分是二者的混合物，最后部分是三尖杉酯碱。

3）高效液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法具有分离效能好、灵敏度高、分析速度快的优点，能使很多其他色谱法难分离的混合生物碱得到分离。HPLC法分离生物碱时，可用硅胶吸附色谱柱，也可用C18反相色谱柱。此外，制备性薄层色谱、干柱色谱、中压或低压柱色谱等也常用于分离生物碱。上述介绍了几种生物碱分离方法，对于某些植物中生物碱种类较多、结构相似者，仅靠其中一种方法很难分离出生物碱纯品，一般需要多种分离方法配合应用。

5．水溶性生物碱的分离

水溶性生物碱主要指季铵碱，其分离一般可用下述方法。

（1）沉淀法。

水溶性生物碱可用沉淀试剂使之从水溶液中沉淀出来，与留在滤液中的水溶性杂质分离，以获得纯度较高的水溶性生物碱或其盐。实验室中常用雷氏铵盐沉淀试剂，工业生产因其价格较高而不常用。

下面介绍用雷氏铵盐纯化季铵碱的一般操作步骤：

1）沉淀季铵碱：将含季铵碱的水溶液用稀无机酸溶液调pH 2～3，加入新配制的雷氏盐饱和水溶液，生物碱的雷氏盐即沉淀析出，沉淀完全后滤过，用少量水洗涤沉淀，至洗涤液不呈红色为止。

2）柱色谱净化：生物碱的雷氏盐用丙酮溶解后，滤除不溶物。将滤液通过氧化铝短柱，以丙酮洗脱并收集洗脱液。生物碱雷氏盐被丙酮洗脱，一些极性杂质被氧化铝柱吸附而除去。在上述洗脱液中加入硫酸银饱和水溶液至不再产生雷氏银盐沉淀为止，滤除沉淀，生物碱转化为硫酸盐留在溶液中。加入与硫酸银摩尔数相等的氯化钡溶液（剧毒）于溶液中，生成硫酸钡和氯化银沉淀，滤除沉淀，生物碱转化为盐酸盐留在溶液中，浓缩滤液，可得到较纯的季铵碱盐酸盐结晶。

用雷氏铵盐纯化水溶性生物碱的化学反应式如下图1-3-7：

（2）溶剂法。

利用水溶性生物碱能够溶于极性较大而又能与水分层的有机溶剂（如正丁醇、异戊醇或氯仿-甲醇的混合溶剂等）的性质，用这类溶剂与含水溶性生物碱的碱水液反复萃取，使水溶性生物碱与强亲水性的杂质得以分离。

（十）鞣质的提取与分离

1．鞣质提取

提取鞣质类化合物要在选择合适溶剂的基础上，注意控制提取的温度和时间，力求快速、完全，以达到不破坏鞣质之目的。用于提取鞣质的中药原料最好用新鲜原料，且宜立即浸提，也可以用冷冻或浸泡在丙酮中的方法贮存。原料的干燥宜在尽可能短的时间内完成，以避免鞣质在水分、日光、氧气和酶的作用下变质，尤其是在研究鞣质及其有关化合物的生源关系时，应更加注意这一点。

经过粉碎的干燥原料或新鲜原料（茎叶类）可在高速搅碎机内加溶剂进行组织破碎提取，然后过滤得到浸提液。组织破碎提取法是目前提取鞣质类化合物最常用的提取方法。

提取鞣质时使用最普遍的溶剂是50%～70%（V/V）含水丙酮，其比例视原料含水率而异。含水丙酮对鞣质的溶解能力最强，能够打开中药组织内鞣质-蛋白质的连接链，使鞣质的抽出率提高，减压浓缩很容易将丙酮从提取液中回收，得到鞣质的水溶液。

2．鞣质的分离

上述提取得到的粗总鞣质，仍然是一混合物，需要进一步分离、纯化。由于鞣质是复杂的多元酚，有较大的分子量和强的极性；且又常是由许多化学结构和理化性质十分接近的化合物组成的复杂混合物，难于分开；同时鞣质的化学性质比较活泼，在分离时可能发生氧化、缩合等反应而改变了原有的结构等，因此与其他类型中药成分相比，鞣质的研究进展较为缓慢。近年来，随着各种色谱的发展及应用，才使鞣质的研究有了迅速的发展。即使如此，鞣质的分离和纯化仍然是鞣质研究中十分费时而又困难的工作。将鞣质制成甲醚化或乙酸酯衍生物有助于鞣质的分离。目前缩合鞣质中绝大部分高聚物的纯化合物都是以甲基醚或乙酸酯的形式分离出来的。

对于鞣质的分离及纯化，经典方法主要有沉淀法、透析法及结晶法，现在常用色谱法。

（1）溶剂法。通常将含鞣质的水溶液先用乙醚等极性小的溶剂萃取，除去极性小的杂质，然后用乙酸乙酯提取，可得到较纯的鞣质。亦可将鞣质粗品溶于少量乙醇和乙酸乙酯中，逐渐加入乙醚，鞣质可沉淀析出。

（2）沉淀法。利用鞣质与蛋白质结合的性质，可从水溶液中分离鞣质。向含鞣质的水溶液中分批加入明胶溶液，滤取沉淀，用丙酮回流，鞣质溶于丙酮，蛋白质不溶于丙酮而析出，这也是将鞣质与非鞣质成分相互分离的常用方法。

（3）柱色谱法。柱色谱是目前制备纯鞣质及其有关化合物的最主要方法。普遍采用的固定相是Diaion HP-20，Toyopearl HW-40，Sephadex LH-20及MCI Gel CHP-20（Mitsubishi Chemicals Industries，Ltd.）。以水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮为流动相（洗脱剂）。以上各种柱色谱在分离过程中主要是吸附色

谱过程，分离效果甚佳。现在已经成为分离可水解鞣质及缩合鞣质的常规方法。

利用Sephadex LH-20柱对提取物进行初步分组的方法如流程图1-3-8所示。依次采用不同的流动相进行洗脱，可得到不同的组分。

在分离鞣质时，也常采用多种柱色谱相结合的方法。在上述柱色谱中，其组合使用的顺序一般为Diaion HP-20 →Toyopearl HW-40→MCI Gel CHP-20 ，因它们在水中吸附力最强，故开始先用水冲洗，洗脱出一些多糖、多肽及蛋白质等水溶性杂质。然后依次用10%，20%，30%，40%，……，（V/V）含水甲醇洗脱，最后用70%（V/V）含水丙酮洗脱。

经MCI GHP-20P柱色谱后的各洗脱流份过程中即可用HPLC检测，单一组分者合并后回收溶剂，即可得到单体鞣质化合物。

（4）高效液相色谱（HPLC）法。HPLC法对鞣质不仅具有良好的分离效果，而且还可以用于判断鞣质分子的大小、各组分的纯度及α,β-异构体等，具有简便、快速、准确、实用性强等优点。

正相HPLC采用的分离柱多为Superspher Si 60及Zorbax SIL；检测波长为280 nm；流动相为环己烷-甲醇-四氢呋喃-甲酸（60∶45∶15∶1 V/V）＋草酸500 mg/1.2L；反相HPLC采用的分离柱多为Lichrospher RP-18；检测波长为280 nm；温度40℃；流动相为：①0.01 mol/L磷酸-0.01 mol/L磷酸二氢钾-醋酸乙酯（85∶10∶5）。②0.01 mol/L磷酸-0.01 mol/L磷酸二氢钾-乙腈（87∶13）。

可水解鞣质分子大小的判断：测定用样品的制备一般为原料用70%（V/V）含水丙酮室温破碎提取，提取液减压浓缩至干，再用适量无水甲醇溶解，离心除去不溶物即可用于正相HPLC。可水解鞣质依据葡萄糖核的数目可分为单体（monomer）、二聚体（dimer）、三聚体（trimer）及四聚体（tetramers）等。因其分子大小及基团极性的不同，从而使其正相HPLC的保留时间（tR）产生显著的正比差异。在同一流动相中，分子量越大，tR越大。因而利用正相HPLC可以初步判断样品中各组分的分子大小情况。

缩合鞣质也有类似现象。利用这一方法对于进行中药中所含鞣质分子大小的预试验非常有用。各组分纯度及α,β-异构体的判断：在对粗鞣质进行柱色谱分离时，需要对各个流份进行纯度检查。正、反相HPLC则能达到快速准确目的。反相HPLC一般具有更加灵敏准确的优点，尤其是在判断葡萄糖的C1-OH是否游离从而表现为α,β-异构体方面有独到之处。例如当用正相HPLC展开，被测样品呈现为单峰，而用反相HPLC展开呈现双峰时，就可能有两种情况，一是样品不纯，为二个组分混合物；二是样品中的葡萄糖部分C1-OH游离，从而形成的α,β-对端基异构体。这两种情况的区别方法是，在被测样品中加入少量NaBH4，振摇，还原反应完成后，在同样条件下进行反相HPLC，若原来的双峰消失，产生了新的比原来的双峰tR较小的单峰，则该样品为α,β异构体，不需进一步分离；若无变化，则说明该样品为两成分的混合物，需进一步分离。