实验七　使用氨基酸分析仪测定蛋白质含量

一、实验原理

（一）氨基酸化学反应原理

自然界中的氨基酸种类很多，但组成蛋白质的氨基酸只有20多种，从结构式上来看，组成蛋白质的氨基酸除甘氨酸以外，都有一个不对称碳原子，即α-碳原子，α-碳原子有四个不同的取代基：COOH羧基、NH2氨基、H氢原子和R基团，不同氨基酸的R基团不同。氨基酸的R基团又称为侧链，由于不同氨基酸的侧链不同，它们的相对分子质量、解离程度、化学反应、性能均不同。除甘氨酸外，每种氨基酸都有L-构型、D-构型。氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它们都能产生氨基与羧基的一般反应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和反应等。

（二）氨基酸分析检测原理

茚三酮柱后衍生氨基酸分析检测法是用水解的方法将蛋白质的肽链打开成单一的氨基酸，利用氨基酸在低pH的条件下带正电荷，在阳离子交换树脂上依照碱性氨基酸结合力最强，芳香族氨基酸、中性氨基酸次之，酸性氨基酸结合力最弱的原则进行吸附。之后利用氨基酸分析仪设定的洗脱程序，采用不同离子强度、pH的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同从树脂上洗脱下来。被洗脱下来的氨基酸与水合茚三酮共同加热后被氧化分解产生二氧化碳、氨和醛，茚三酮被还原。在弱酸性溶液中，还原茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物茚二酮胺（图1-7-1），该物质在570nm处有最大吸收峰。同时脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，该物质在440nm处吸收峰最大。这些生成物在分光光度计中进行检测。由于氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺序一定、浓度一定、洗脱峰的面积一定，根据未知样品中氨基酸洗脱面积与氨基酸标准液的洗脱面积的比即可推算出样品中各种氨基酸的含量。

二、样品准备

对样品进行氨基酸分析之前，需要进行适合该样品的前处理，前处理分为两大系统，一个是由蛋白质加水分解而得到氨基酸的分析法；另一个是以氨基酸及其有关联的化合物为对象，对游离氨基酸的测定法。此外，原则上需用0.45μm的过滤器对样品过滤。

（一）蛋白质样品的制备

用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，常用的水解方法有三种。

1.酸水解法　称取蛋白质样品适量（100mg左右为宜）放入水解管中，加10mL、6mol/L的HCl，置于液氮或干冰中冷冻，然后抽真空至7Pa（＜5×10mm汞柱）后封口，将水解管放在110℃恒温干燥箱内水解22h。冷却后，开管、定容、过滤，取适量的滤液置60℃的旋转蒸发器或浓缩器中抽真空蒸发至干，必要时可加少许水重复蒸干1～2次，加入样品稀释液将样品稀释到所需浓度，摇匀、过滤，待用。目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺均为酸水解法。该方法的优点是HCl本身加热可以蒸发除掉；缺点是溶液显黑褐色，这是与含醛基化合物作用的结果。

2.碱水解法　称取蛋白质样品适量（100mg左右为宜）置于聚氟乙烯衬管中，加1.5mL LiOH（浓度4mol/L），于液氮干冰中冷冻，然后将衬管插入水解管中，抽真空至7 Pa或充氮气5min以上封管，然后将水解管放入110℃恒温干燥箱，水解20 h。取出水解管冷却至室温，开管加入1mL浓度为6mol/L的盐酸中和，用样品稀释液定容稀释至所需浓度，摇匀、过滤，待用。该方法的优点是水解液清亮，但存在放出氨气和硫化氢等缺点。

3.酶水解法　酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。特点是水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类；此方法主要用于生产水解蛋白及蛋白肽。但一般水解时间长，而且不易水解完全。

（二）游离氨基酸样品的制备

游离氨基酸的样品在分析前必须进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用18 C过滤柱处理一下。一般称取1～2g样品，加入0.1mol/L盐酸提取液30mL搅拌提取15min，沉放片刻。将上清液过滤到100mL的容量瓶中，残渣加提取液搅拌，重复提取两次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗提取液瓶和滤纸上的残渣并定容摇匀，清液待用。

（三）生理体液样品的前处理

生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质的化学方法如下：

1.苦味酸法　用1%的苦味酸沉淀，然后过18C柱子除苦味酸，再把氨基酸从柱子上洗脱下来进行分析。

2.三氯醋酸法　三氯醋酸即生物碱沉淀剂，医院临床生化常用此类试剂沉淀血浆中的蛋白质。

（1）血液。

①把血液用7000～10000r/min（7000～10000 G）离心分离15min。

②在澄清液中加入5%～10%三氯醋酸，稀释2～3倍。

③用7000～10000r/min（7000～10000G）离心分离15min。

④将澄清液作为样品。

（2）尿。

①在原尿中加入1%三氯醋酸再稀释2～5倍（由于有异常的尿有大量的氨基酸出来，所以要提高稀释倍率）。

②有混浊时，进行过滤或者离心分离。

③得到的液体取0.05～0.1mL作样品。

3.乙醇沉淀法　当乙醇加入含蛋白质的水溶液中，可使蛋白质表面失去水膜，并增大颗粒间的引力，引起蛋白质沉淀。

4.磺基水杨酸法（常用的方法）用4%～10%的磺基水杨酸，按1:3的比例与样品混合离心去蛋白，转速20000r/min以上离心10min或更长时间，取上清液用样品稀释液稀释后上机测定，建议进样前用18C预处理过滤柱。

三、实验仪器简介

日立L8900氨基酸分析仪是采用经典的阳离子交换色谱对氨基酸进行分离，并对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行定性定量分析的仪器（图1-7-2）。样品中的蛋白质经过水解，其产物采用茚三酮柱后衍生法进行分离，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，生成紫色化合物，用可见光检测器测量其在570nm的吸收光度（脯氨酸和羟脯氨酸在440nm测量），与标准溶液吸光度进行比较，即可计算出样品中氨基酸的含量。氨基酸分析仪的检测流程见图1-7-3。L8900氨基酸分析仪具有分析时间短、灵敏度高、分离度高等特点，并且拥有氮气自动鼓入和茚三酮回流保护装置，同时采用高能量卤素灯、消相差凹面衍射光栅，满足仪器长时间测定工作的需要。可用于分析检测样品中蛋白水解氨基酸、游离氨基酸的种类及含量，广泛应用于食品、纺织等领域检测。

四、实验操作步骤（一）联机

依次打开计算机、仪器主机电源，双击桌面的主机图标，进入程序。在菜单栏中依次点击“Contral”“Instrument Status”“Cornect”联机，等待2min完成初始化。当Uninitialized变成Idle，各个组件可以进行控制。初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升，分离柱的温度会升到50℃。氨基酸分析仪初始化界面如图1-7-4所示。

（二）编辑Sequence序列表

依次点击“File”“Sequence”“Sequence Wirard”“Next”，根据需要填写样品序列存储路径、存储方式、样品个数及检测重复次数等参数（图1-7-5）。

点击“Next”，出现图1-7-6画面，根据需要填写测试样品的起始位置、间隔、标准品的起始及样品注入体积。

点击“Next”，出现图1-7-7画面，根据需要填写标准品存储路径、方式及个数。

点击“Finish”，出现Sequence的列表。通过复制、编辑，最终将Sequence编辑完成，如图1-7-8所示。注意此时，第一行是再生程序（RG），进样体积为0，Run Type是Unknown；第二行是标准样品，进样体积为20；第三行起是未知样，进样体积为20，并保存Sequence文件。

（三）采集数据

点击“Control”→“Single Run”→“Sequence Run”，运行程序。数据采集完后，机器自动进入清洗程序，清洗1h后自动关泵，关闭光源及柱温箱。

（四）报告生成

依次点击“Method/Custom Report”→“Open”→“Open Report Template”，打开报告书模板，选择PH（small）、Srp作为例子，点击Open按钮。然后点击定制报告书界面“Print”图标，生成打印报告（图1-7-9）。

（五）关机

点击“disconnect”，断开连接，然后依次关闭程序及主机电源。

五、实例分析

（一）检测纤维或织物中氨基酸的含量

利用氨基酸分析仪，能够简单快速地对蛋白质样品的氨基酸种类及含量进行定性定量分析。常见氨基酸种类及简称见表1-7-1。本实例分析主要选择家蚕丝为测试对象，分析样品中的氨基酸含量与种类（图1-7-10），并系统讨论前处理条件对测试条件的影响与优化。

表1-7-1　常见氨基酸种类及简称

1.样品中的氨基酸浓度　每种仪器都有其比较合适的进样量及进样浓度，浓度过大或过小对分析结果都是不利的。过高浓度的丝素水解样品注入仪器后会造成仪器管路的堵塞，容易污染柱子；过低浓度的样品注入仪器后会造成个别氨基酸分离不好，影响定量分析的准确性。最好是在进样前对样品浓度进行预估算，将样品浓度配到仪器要求的合适范围。图1-7-11是进样浓度为氨基酸分离效果的影响。

2.缓冲液pH及钠离子浓度　缓冲液的pH和钠离子浓度对样品中各个氨基酸的洗脱及分离起着重要作用，若pH和钠离子浓度不当，会出现氨基酸出峰提前、错后以及重叠现象。当缓冲液pH偏酸时，酸性氨基酸出峰时间会推后，造成丙氨酸与胱氨酸的峰重合，亮氨酸与酪氨酸分离度降低；当缓冲液pH偏碱时，酸性氨基酸出峰时间会前移，造成苏氨酸、丝氨酸与谷氨酸，缬氨酸与蛋氨酸，酪与苯丙氨酸不能完全分离。当钠离子浓度过低时，氨基酸出峰的峰形会加宽，出峰时间推迟；钠离子浓度过高时，会造成氨基酸出峰太快，影响分离效果。实验时应以分离谱图最佳为原则来控制缓冲液的pH和钠离子浓度（图1-7-12）。

3.氨　当缓冲液、样品或流路系统中混入氨时，会使基线在碱性氨基酸出峰处被抬高，影响碱性氨基酸分离效果和定量的准确性。溶液中的氨主要来自离子水生产过程中混入的氨，以及试剂因等级不高而混入的氨。在分析过程中，当pH低时，混入的氨会被树脂所吸附，随着缓冲液pH的逐步升高，溶液中的氨再逐渐被洗脱下来，使赖氨酸、组氨酸、精氨酸分离定量的精确度受到影响。目前有些氨基酸分析仪为了解决流路中氨的问题，在自动进样器前加一根除氨柱，用来吸附溶液中的氨，防止其在分析过程中被洗脱（图1-7-13）。

4.茚三酮　茚三酮溶液的好坏直接关系着氨基酸出峰面积的大小，进而影响氨基酸分析结果的准确性。茚三酮反应溶液如果长时间暴露在空气中会被氧化失效，同时缓冲液中的溶解氧也会对茚三酮显色效果造成影响，所以在配制茚三酮溶液时应注意，要通入足够时间的氮气以排除溶解氧，而且试剂表面应充满氮气保护，防止其暴露在空气中被氧化而失效。

5.光源　由于反应的氨基酸浓度不同，会与茚三酮溶液反应生成深浅不一的蓝紫色化合物茚二酮胺（DYDA）。氨基酸的浓度与DYDA的吸收度成线性关系，也就是说，吸收率反映氨基酸浓度的大小。当仪器的光源不佳时就会直接影响氨基酸定量分析的准确性，灵敏度也会降低。实验过程中要及时检查仪器光源的能量值，保证定量分析的准确性。

（二）辨别混纺织物的种类

通常动物纤维混纺类织物鉴别的方法是利用显微镜和扫描电镜等仪器采用观察法对纤维的主要形态特征进行辨别。但纤维的形态特征有时会因气候、环境及处理工艺等发生变化，这就加大了纤维鉴别的难度。例如，在光学显微镜下就很难将羊绒纤维与经丝光处理后的部分毛纤维进行区分。并且采用观察法鉴别纤维主观干扰较大，对检测人员的经验要求也相对较高，难以准确定性分析。随着氨基酸分析技术的发展，利用氨基酸分析技术定性定量分析不同纤维的特征氨基酸来实现对混纺织物鉴别的方法越来越受到研究人员的青睐。利用氨基酸分析仪就能够快速简便地对桑蚕丝和柞蚕丝进行区别。桑蚕丝素蛋白中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸的含量占氨基酸总含量的90%以上，其中甘氨酸含量最高，是桑蚕丝最主要的特征氨基酸（图1-7-14）。柞蚕丝素蛋白中丙氨酸的含量最高，并且精氨酸、赖氨酸等氨基酸的含量也明显高于桑蚕丝素蛋白中精氨酸、赖氨酸含量，以此作为柞蚕丝的特征氨基酸，利用氨基酸分析技术能够有效地与桑蚕丝进行区别（图1-7-15）。