实验六　使用圆二色光谱仪（CD）分析蛋白质溶液的二级结构

一、实验原理

（一）圆二色性

手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同，出射时电场矢量的振幅不同。通过样品后，再次合成的偏振光就不是圆偏振光，而是椭圆偏振光。圆二色性是研究分子立体结构和构象的有力手段。在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差1/4波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二色性。圆二色性用摩尔吸收系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM=εL-εR。其中，εL和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。如果εL-εR＞0，则ΔεM为“+”，有正的圆二色性，相应于正Cotton效应；如果εL-εR＜0，则ΔεM为“-”，有负的圆二色性，相应于负Cotton效应。由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。

圆二色性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。[θ]和圆二色性用摩尔吸收系数差ΔεM之间的关系式[θ]=3300×ΔεM。圆二色光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二色谱仪测定。若仪器测定的是椭圆度θ，则存在ΔεM=θ/（33c·l）的换算关系。其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。

（二）圆二色光谱仪工作原理

圆二色光谱仪主要由光源、单色仪、起偏器、调制器、光探测器等单元组成。圆二色光谱仪一般采用氙灯作光源，调制器则受电压信号控制，将平面偏振光调制成左、右圆偏振光。调制器输出的光作为入射光照射在样品上，如果样品在此波长下有圆二色性，那么透射光的光强也随着左、右旋圆偏振光的交替变化而变化。光电倍增管把光强转换为电流，也将变化的光强信号转换为交流信号。这个交流信号的强度就反映了样品在这个波长下的圆二色性的数值大小，用θ表示，圆二色数值的单位是椭圆度。改变波长λ，测量不同波长处样品的θ，就得到样品的圆二色光谱。同时，测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧，防止臭氧腐蚀反射镜（图1-6-1）。

二、样品准备

（一）溶液类样品

把样品加入分散性较好，并在测试波长范围内没有紫外吸收的溶剂中，加入一定光程的比色皿中，固定后置于样品舱中等待测试。其中，需要注意溶剂和样品浓度两方面。

1.溶剂的选择　在测试样品时，首先要排除溶剂的紫外吸收对测试的影响，溶剂的最大吸收波长要小于物质的最大吸收波长。测试时一般选用高纯水和光谱纯的醇类溶剂。

2.确定溶液浓度的影响　一般吸收峰遵循朗伯·比尔定律：A=ε×l×c，其中ε为与波长有关的吸光系数，l为光程，c为样品浓度。圆二色光谱测量的是两种圆偏正光吸收的差值（Δε=εl-εd）（εl为左圆偏正吸收系数，εd为右圆偏正吸收系数）。虽然朗伯·比尔定律表明CD信号与浓度成正比，但并不是浓度越高，CD信号越好。因为Δε值非常小，浓度增加后可测光的强度则减少，此时吸光度的微小变化则被噪声掩盖，而且噪声值随光强而变，光强越小噪声越大，出现逆浓度效应。所以样品在测量CD以前一般先测量下UV/VIS吸收光谱，当样品的UV/VIS吸收值在0.5～1.0时，会得到比较好的CD数据。当样品的UV/VIS吸收值大于2.0时，将很难得到较好的CD信号。在波长确定的情况下，理想的浓度对应吸光度应在0.8左右。

（二）固体粉末类样品

1.溶剂分散法　把样品加入分散性较好，并在测试波长范围内没有紫外吸收的溶剂中，充分超声分散后，放入测试槽，加入搅拌子，在搅拌分散状态下测试。

2.压片法　样品与惰性介质（KBr或KCl）按一定的比例混合压片，放入测试槽即可测试。

3.石蜡油混合法　样品与适量的石蜡油混合研磨，均匀涂在石英片上。

4.成膜法　将样品溶液滴加或旋涂在石英片上，待溶剂挥发成固体薄膜后检测。在固体样品的测试中，除单晶固体测试法外，其他几种方法都需要找到合适的样品与介质混合的比例。当比例太小时，CD信号有可能太弱；但比例过大时，吸收波长会红移并会出现逆浓度效应，使CD信号失真。

（三）凝胶类样品

有些高分子材料为凝胶状，对于刚性较强的样品只要涂在片状比色槽里，即可测试。对于柔性高分子或超分子组装体样品可以加入比色皿中，把比色皿放入仪器，加热到60℃，当样品融为溶液状态时，再调节到室温待样品自组装成较均一的凝胶状后进行测试。

三、实验仪器简介

本实验采用的是日本JASCO公司J-815圆二色光谱仪（简称CD）。图1-6-2为J-815仪器图片及其光路图，图中，S1-S2：第一级单色器；S2-S3：第二级单色器；M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L：透镜；F：滤光器。常见配件包括PTC-423S/15变温、Stop-flow停留、荧光光谱配件等。

该仪器具有高的扫描速度、广泛的波长领域，可以同时多通道测定。仪器有高亮度的点光源，色温接近6000K。同时具有显色指数＞95的高显色性，能够使仪器在整个寿命期内维持光色特性；仪器具有热重启能力，且启动后即能达到接近最大光输出；电弧光斑小、易聚光。

四、实验操作步骤

（一）开机

打开N2，等待N2打开5min后，打开主机电源，确认听见光栅移动的声音后依次打开水循环、电源开关和计算机主机。

（二）联机

双击桌面“Spectra Manager”图标，进入操作界面。双击J-815目录下“Spectra Manag-er”，等待联机完成（图1-6-3）。

（三）参数设置

点击“Specta Measure”，进入General界面，点击“Parameter Settings”，设置通道数、起始及结束波长、扫描方式、扫描速度、灵敏度、光谱带宽并选择控制器（图1-6-4）。

1.通道选择　J-815可以设置三个通道，包括CD信号、HV信号、Abs信号。

2.波长测量范围选择　J-815可测量的波长范围为163～900nm。一般先测量待测样品的紫外吸收光谱，圆二色光谱的波长检测范围一般可在有紫外吸收波段两端再各加50～100nm。

3.数据采集时间间隔　在全谱扫描时，数据采集时间间隔通常选择0.2nm；若扫描模式设置为[step]，数据采集时间间隔通常设置为1nm。

4.扫描速度　扫描速度一般随响应时间改变而改变。通常，测量时将扫描速度设置在20～100nm/min，响应时间在0.25～2s。表1-6-1列举了常见扫描速度与响应时间的对应关系。

表1-6-1　常见扫描速度与响应对应表

5.光谱带宽　标准操作时，光谱带宽选为1nm。当样品的CD信号很小时，若想保持测试的CD信号，就需要足够的样品浓度及较宽的狭缝宽度。若采用高分辨率测量时则需要用较窄的狭缝宽度，但此时光电倍增管电压较高，信噪比差。

（四）设置比色皿宽度

点击“Cell Length”，填写石英比色皿的宽度。高度均匀的熔融石英比色皿，不会带来附加的圆二色性。为了降低溶剂对测试结果的影响，一般选用短光程、宽度为0.01～1cm的石英比色皿。

（五）基线校准

点击软件操作界面上“B”，将装有待测样品溶剂的比色皿放入仪器中，关好舱门，进行基线测试。

（六）样品测试

基线校准完成后，将样品装入比色皿中，表面擦干后，打开机器舱门放入比色皿，盖上舱门。点击软件操作界面上“S”，进行样品测试。测试过程中，若HV信号值大于600 mV时，立即点击“Stop”，暂停此次测试。取出样品，重新调节样品浓度及容量，重复上述步骤。测试完毕后，立即取出样品，关好舱门，勿关氮气（图1-6-5）。

（七）数据传输

点击“Measure”，进入Data界面，在Send to Analysis目录下选择“Send Data to Spectra Analysis”，完成测试后将数据自动发送到Spectra Analysis目录，进行数据分析处理（图1-6-6）。

（八）数据处理

单击“Open”，打开刚刚测试完毕的图谱，进行谱图分析。依次单击“Processing”“Smoothing”进行曲线平滑。依次单击“Processing”“Peak Processing”“Peak Find”，进行主峰寻找（图1-6-7）。

（九）数据保存

右击J-815目录下的该文件，Save As保存原始文件及.txt文本。格式化后的U盘进行数据拷贝。

（十）关机

依次关闭软件、水循环、电源开关及J-815主机电源。通氮气5min后再关闭氮气。

五、实例分析

（一）研究物质的手性情况

圆二色光谱是与化合物的光学活性相关的光谱，可以提供许多分子的结构信息。一方面，利用圆二色光谱仪可以对手性分子的结构进行测定，根据CD信号值的不同可以判断手性物质为左旋或右旋，区别异构体，也可以作为定性鉴定物质的依据；另一方面，样品的吸光度则与浓度成正比，可作为定量分析的参考依据。图1-6-8是不同构型的苯丙氨酸的CD光谱图。从图中可以看出，苯丙氨酸D型[图1-6-8（a）]和L型[图1-6-8（b）]的CD光谱图有显著区别，其中D型的CD值大于零，而L型的CD值小于零。利用CD图谱，可以快速简便地辨别苯丙氨酸的构型。

（二）鉴别物质种类

不同波长的CD谱能够反映物质的不同结构信息。190～240nm波长范围内，主要反映肽链的结构；240～330nm波长范围内，能够反映蛋白质芳香族及二硫键结构信息；330～750nm波长范围内，主要表现出血红素、辅基及金属离子的情况，这一波段CD谱常用于研究金属离子的氧化态、配位体以及链—链相互作用；而大于750nm波长的信号，主要是分子振动的信息。如图1-6-9所示，色氨酸在290nm及305nm处有精细的特征CD峰，酪氨酸在275nm及282nm有CD峰，苯丙氨酸在255nm、260nm及270nm有弱尖锐的峰。利用CD特征吸收光谱，可以简单便捷地对芳香氨基酸残基中这几种特征氨基酸进行区别。

（三）研究蛋白质的二级结构

近几年来，圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用越来越广泛。通过对远紫外圆二色光谱的测量，可以推导出稀溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别蛋白质的三级结构类型；通过对近紫外圆二色光谱的测量和分析，可以推断蛋白质分子中芳香氨基酸残基和二硫键的微环境变化，研究介质与蛋白质结构间的关系；通过测定实验参数和环境条件变化时的圆二色光谱，可以研究蛋白质构象变化过程中的热力学和动力学特性。图1-6-10为蛋白质二级结构CD特征吸收光谱。