2.4　生物氢气制备与利用

氢（H，hydrogen）是所有原子中最小，位于元素周期表第一位的元素。氢是最丰富的元素，宇宙中75%的质量由氢元素构成。H₂是密度最小的气体，在0℃和标准大气压下，H₂密度为0.0899g/L，仅为空气密度的1/14。H₂具有无色、无味、无臭、易燃的特点。常压下沸点为-252.8°C，临界温度为-239.9℃，临界压力为1.32MPa，临界密度为30.1g/L。在空气中体积含量为4.0%～74%时，即形成爆炸性混合气体。液态氢是无色透明液体，有超导性质。H₂难溶于水，常温性质很稳定，不容易跟其他物质发生化学反应。在一定条件下，可以和O、C、N等发生化学反应，生成水、烃类化合物、NH₃等。

在所有可替代性能源当中，氢能源被人们普遍认为是最经济、高效、环保和可再生性强的新型能源^［20］。在20世纪70年代的世界性能源危机中，H₂被称为“未来燃料”，受到了广泛的研究和推崇。到了90年代，氢能源以其污染“零排放”的特性，被人们正式列为化石能源的替代性能源。

与传统的能源燃料相比，H₂具备以下显著的特点。

①氢是最丰富的元素，氢能的来源多样化　氢元素及其同位素占到了太阳总质量的84%，宇宙总质量的75%。由于氢的性质比较活跃，自然界中主要以化合物的形式存在，如水和烃类化合物石油、天然气等。而水是地球的主要资源，海洋的总体积约为13.7×10¹⁷m³，如果能把其中的氢提取出来，总量约为1.4×10¹⁷t，所产生的热量是地球上化石燃料的9000多倍^［21］。氢能可以通过各种一次能源获得，如煤矿、石油、天然气等化石燃料，也可以通过太阳能、风能、生物质能、海洋能、地热等可再生能源获得。地球各处都有可再生能源，不像化石燃料，在地球上分布不均，具有很强的地域性。

②燃烧值高　氢是周期表中最轻的元素，与其他物质相比，具有最高的能量比。表2-16是几种物质的燃烧值。其中氢气燃烧值最高达到121kJ/g；而汽油仅44kJ/g，喷气飞机用燃料为51kJ/g，煤仅为30kJ/g。与同质量的化石燃料相比，H₂燃烧所释放的能量是汽油的3倍，乙醇（酒精）的3.9倍，焦炭的4.5倍。

③氢能是清洁环保的能源　H₂燃烧时和氧结合生成水，不产生CO、CO₂、烃类化合物等温室气体和其他对人体有害的物质，也不会产生烟尘排放，不会对环境产生污染。

④ 化学简单性　氢在快速释放能量时，破坏和形成的键相对很少，具有高的快速反应速率常数和较快的电极过程动力学，可以用电化学方法释放能量。氢在铂电极上放电时的交换电流密度（不施加电压时，基本的动态电荷转移速率）达1mA/cm²。

⑤ 氢能的利用形式多样化、利用效率高　氢不仅可以直接燃烧提供热能，还可以用作燃料电池的原料直接转化为电能，或转换成固态氢用作结构材料。这也是当今研究领域比较推崇的能源使用形式。当氢作为燃料电池燃料使用时，其能量转化效率高达60%～80%，是煤炭转为电能的2倍多。

⑥ 氢能的储存、运输、携带方便　氢可以以不同的形态（气态、液态或者固态的金属氢化物）出现，相对于化石燃料来讲，能适应储存、运输和携带的要求。如H₂可以通过简单技术实现液态形式储存：H₂可以通过管道、槽罐等形式实现远距离输送。目前美国已进行管道输送的试点建设工作，累计建设H₂输送管道超过720km。在电力过剩的地方和时段，可以用氢的形式将电或热储存起来。这也使氢在可再生能源的应用中起到其他能源载体所起不到的作用。

⑦ 应用范围广泛　氢作为工业原料和试剂，可以应用于冶金和石油化工等行业。氢可以作为高能燃料，广泛应用于航天飞机、火箭和现代城市交通工具等部门^{［22，23］}。H₂作为保护气体在电子工业和金属高温加工过程中也具有重要的用途。此外H₂可作为催化剂，用于食品工业。

从目前世界氢产量来看，96%是由天然的烃类化合物——天然气、煤、石油产品中提取的，4%是采用水电解法制取的。由于化学方法制氢要消耗大量的矿物资源，而且在生产过程中产生的污染物对地球环境会造成破坏，已不适应社会发展的要求，终将会被淘汰。部分生物质（绿色植物）可以通过一些途径（光合作用等）获得并储存能量，而且自身还能作为氢的载体，含质量分数为6%的氢元素，占生物总能量的40%以上^［24］。利用生物质进行氢气生产，受到世人关注。与传统的物理化学方法相比，生物制氢具有清洁、节能和不消耗矿物资源等突出优点，是一种环境友好的清洁能源技术。而且生物质自身具有可再生性，是一种可再生能源。生物质可以通过光合作用吸收环境的CO₂，实现CO₂零排放，从本质上避免了化石能源制氢时产生的环境污染问题。

因此，生物质制氢的路线是一种坚持可持续发展路线的能源表现，也是一种环境友好的清洁能源技术。目前，生物质制氢技术主要分两类：一类是利微生物转化制氢，如厌氧发酵法制氢、光合法微生物制氢等；另一类是生物质原料通过热化学技术制取H₂，如生物质气化制氢、生物质热裂解制氢、超临界水气化制氢等。从生物质中制取H₂的方法见图2-43^［25］。

2.4.1　生物制氢机制

目前的生物制氢方法可以归纳为三种^［26］：生物光解制氢、光合细菌制氢和厌氧暗发酵制氢。光合微生物的种类非常繁多，因此其产氢机制也多种多样。

2.4.1.1　生物光解制氢

光解水制氢是微藻及蓝细菌利用光能提供的能量和自身独特的产氢酶系，以太阳能为能源，以水为电子供体，通过光合作用将水分解为氢气和氧气的过程。此制氢过程不产生C。其反应方程式见式（2-26）。

　　（2-26）

微藻和蓝细菌的光合作用类似于绿色植物的光合作用，在某些藻类和蓝细菌体内拥有PSⅠ、PSⅡ两个光合中心，PSⅠ产生还原剂用来固定CO₂，PSⅡ接收太阳光能分解水产生H⁺、电子和O₂；PSⅡ产生的电子，由铁氧化还原蛋白携带，经由PSⅡ和PSⅠ到达氢酶，H⁺在氢酶的催化作用下形成H₂。其中，利用藻类光解水产氢的系统称为直接生物光解制氢系统，利用蓝细菌进行产氢的系统称为间接光解水产氢系统。作用机制见图2-44^［28］。

（1）黑体后直接生物光解制氢

直接生物光解制氢是直接利用光系统裂解水释放的电子经过铁氧化还原蛋白（Fd，简称铁氧还蛋白，下同）传递给氢酶后，产生H₂的过程。植物和藻类通过光合作用生成有机化合物，而产氢藻类可通过相同的生物过程按以下反应生成H₂。微生物产氢的具体过程如图2-45所示^［29］。

这一过程涉及光吸收的两个不同系统，裂解水和释氧的光系统（PSⅡ）与生成还原剂用来还原CO₂的光系统（PSⅠ）。在光合系统的第二个阶段（PSⅡ），氧化侧从水中获得电子并产生氧气，经过一系列光驱动下的生化反应，电子的能量得到升级，最终达到第一阶段（PSⅠ）的还原侧并传递给氢酶，由氢酶传递给氢离子从而产生H₂。在这两个系统中，两个光子（每一系统一个光子）用了从水中转移一个电子生成H₂，产生的气体中H₂∶O₂为2∶1。

在无氧情况下，氢酶可以利用还原型铁氧还蛋白中获得的电子（e^-）产生质子（H⁺）并参与H₂的产生。其反应方程式见式（2-27）^［30］。

　　（2-27）

由于脱氢酶对O₂很敏感，当环境中O₂浓度接近1.5%时，脱氢酶迅速失活，产氢反应立即停止，所以光合过程产生的H₂和O₂必须及时进行分离^［31］。理论上，直接生物光解制氢反应从2mol H₂O中可产生2mol H₂。但是由于反应过程中的酶（主要是氢酶）受到O₂的抑制，使得实际产氢量大幅下降，有报道测定的直接生物光解制氢反应的速率约每升0.07mmol/h^{［32，33］}。

（2）黑体后间接生物光解制氢

间接生物光解制氢将产氢和产氧过程分开，并伴以CO₂的固定反应。蓝细菌具有独特的利用空气中CO₂和太阳能作为能量来源的能力。由于蓝细菌具有很高的产氢能力，因此对蓝细菌的研究比较深入。

蓝细菌或称蓝藻，属革兰氏阳性菌。具有和高等植物同一类型的光合系统及色素，能够进行氧的合成。蓝细菌在形态上差异很大，有单细胞的、丝状的，也有聚居的。所需的营养非常简单，空气（N₂和O₂）、水、矿物盐和光照即可。蓝细菌的许多种属都含有能够进行氢代谢和氢合成的酶类，包括固氮酶和氢化酶。固氮酶催化产生分子氢。氢化酶既可以催化氢的氧化，也可以催化氢的合成，是一种可逆双向酶。

蓝细菌吸收CO₂产生细胞有机物［式（2-28）］，有机物进一步分解产生H₂［式（2-29）］。

　　（2-28）

　　（2-29）

在厌氧暗环境下，丙酮酸-铁氧化还原蛋白酶（PFOR）在丙酮酸脱羧形成乙酰辅酶A的同时通过还原铁氧还蛋白产生H₂。当有光照时，铁氧还蛋白被NADH还原。固氮的蓝细菌主要是通过固氮酶而非双向氢化酶产生H₂。固氮酶可以将N₂转化为NH₃。但是在一些非固氮的蓝细菌中，双向氢化酶（也叫可逆氢酶）也可催化产生。

纤维状蓝细菌细胞内的固氮酶异形胞上，固氮酶只具有PSⅠ活性而无PSⅡ活性。PSⅠ接受来自相邻营养细胞传递的电子，异形胞创造了无氧环境，可以使蓝细菌在无氧条件下进行固氮和产氢。但是间接光解产氢过程由于固氮酶需要大量ATP，并且细胞需要生物合成以及保持异形胞的存在使得H₂的产生耗费大量的能量。一般在实验室内的光能转化率仅为1%～2%，大规模培养时低于0.3%^［35］。具有异形胞的蓝细菌的突变多变鱼腥藻的产氢能力可达到0.355mmol/（h·L）^［36］。

　　（2-30）

　　（2-31）

异形胞的存在使得O₂和H₂的产生位于不同的细胞位置。没有异形胞的蓝细菌可以在不同时间分别产生O₂和。

光解水制氢过程的优点在于：底物充足（水）；产物简单（H₂和O₂）。存在的缺点为：光转化效率低；产生的O₂对氢酶有抑制作用；光生物反应器造价昂贵。

2.4.1.2　光合细菌制氢

光合细菌发酵制氢是在固氮酶或氢酶催化下，将光合磷酸化和还原性物质代谢偶联利用吸收的光能及代谢产生的还原力形成H₂的过程。在光照厌氧条件下，光合细菌通过自身复合体上的细菌叶绿素和类胡萝卜素捕获高能光子，并将能量传递到光合反应中心，使高能光子发生电荷分离产生高能电子。高能电子经过环式磷酸化将光能转化成三磷酸腺苷（ATP），为产氢过程提供能量。产氢过程中所需要的还原力来自有机物的氧化代谢，由细胞内还原性的铁氧蛋白水平所决定。

光发酵的所有生物化学途径都可以表示为：

　　（2-32）

这类微生物不能从水分子中获得电子，因此要以有机化合物为底物，通常是乙酸、丁酸、苹果酸、柠檬酸等小分子有机酸。这类光合细菌的产氢过程如图2-46所示^［38］。

光合细菌产氧和蓝细菌、绿藻一样，都是太阳能驱动下光合作用的结果，但是光合细菌只有一个光合作用中心（相当于蓝细菌、绿藻的PSⅠ），由于缺少藻类中起光解水作用的PSⅡ，所以只进行以有机物作为电子供体的不产氧光合作用。光合细菌所固有的只有一个光合作用中心的特殊简单结构，决定了它所固有的相对较高的光转化效率，具有提高光转化效率的巨大潜力。固氮酶是光合细菌光合产氢的关键酶，在细胞提供足够的ATP和还原力的前提下，固氮酶将N₂转化成NH₃，同时质子化生成H₂［式（2-33）］。产氢是光合细菌调节其机体内剩余能量和还原力的一种方式，对其生命活动非常重要。在光合细菌内参与氢代谢的酶有3种：固氮酶、氢酶和可逆氢酶，催化光合细菌产氢的主要是固氮酶。

　　（2-33）

在光生物反应器中，细胞内PSⅡ的抑制可以产生厌氧环境。这主要是由于在反应系统中，参与水氧化的O₂减少而且剩余的O₂用于呼吸^［39］。硫缺乏也会抑制PSⅡ活性而导致厌氧环境^［33］，这主要是无硫培养中光合放氧逐渐下降，而呼吸耗氧基本不变，光照下衣藻的呼吸耗氧速率大于光合放氧速率，体系中的氧气被消耗，形成厌氧状态，从而诱导氢酶的表达，实现了连续产氢^［40］。PSⅡ反应中心蛋白D1的缺失会导致光抑制^［41］。如果细胞中半胱氨酸和甲硫氨酸缺乏时，D1蛋白的重新生物合成过程将不能完成。厌氧环境将诱导藻体细胞内［FeFe］-产氢酶活性^［42］，因而催化产氢反应^［43］。反应机制见图2-47^［42］。

光合细菌制氢的优势在于可以将有机酸完全转化为H₂和CO₂，在有机废物的生物处理方面有潜在发展前景。但是固氮酶自身需要大量的能量，较低的太阳能转换效率和光合生物反应器占地面积较大，光合生物反应器的设计、运行困难，成本较高。总之，该工艺和其他所有涉及光合过程的工艺的产氢效率都较低，限制了其工业化发展。

2.4.1.3　厌氧暗发酵制氢

厌氧暗发酵制氢（dark fermentation）是指在厌氧和黑暗的条件下利用厌氧产氢细菌将大分子有机物降解产生H₂和其他副产物的过程。暗发酵的副产物通常是酸（乳酸、乙酸、丁酸等）和醇（乙醇、丁醇等）。副产物的含量和种类会受到微生物种类、底物种类、pH值、氢分压、氧化还原电位等因素的影响。与光发酵制氢相比，此方法制氢的优点为不需要提供光源；反应器简单；底物利用范围广，可以利用能源作物或者是农业废物作为发酵底物。暗发酵的产氢路径如图2-48所示^［38］。

产氢发酵细菌能够根据自身的生理代谢特征，通过发酵作用，在逐步分解有机底物的过程中产生分子氢。1965年Gray和Gest在Science上曾发表一篇文章，提出2种可能的产氢途径（梭杆菌属的丙酮酸脱氢途径和肠杆菌属的甲酸裂解途径）^［44］，但最大产氢能力均为1mol葡萄糖产生2mol H₂。经大量实验发现，产氢细菌利用1mol葡萄糖产生的H₂量为1.2～2.1mol（其中包括NADH+H⁺产生的少量H₂），证明Gray和Gest推论的产氢代谢途径是正确的。2000年Tanisho提出还存在NADH+H⁺产氢途径^［45］。综上所述，目前发现细菌产氢途径主要有3种，分别为丙酮酸脱氢途径、甲酸裂解途径和NADH+H⁺产氢途径。

（1）黑体后丙酮酸脱羧途径

复杂糖类经水解后生成单糖，单糖通过丙酮酸途径实现分解，同时伴随挥发酸或醇类物质的生成（图2-49）。微生物的糖酵解经过丙酮酸途径主要有EMP（Embden-Meyerhof-Parnas）途径（又称糖酵解途径或二磷酸己糖途径）、HMP（Hexose Monophosphate Pathway）途径、ED（Entner-Doudoroff）途径（又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖裂解途径）和PK（phosphoketolase）途径（又称磷酸酮解酶途径）4种。丙酮酸经发酵后转化为乙酸、丙酸、丁酸、乙醇或乳酸等。

丙酮酸是物质代谢中的重要中间产物，在能量代谢中发挥着关键作用。由于微生物种群的差异导致丙酮酸的去路不同，因此产氢能力不同（图2-50）。

在丙酮酸不同去路的代谢途径中，目前发现通常丁酸发酵、混合酸发酵和细菌乙醇发酵可以产生H₂，几种与产氢相关的细菌代谢途径见表2-17^［46］。

① 丁酸发酵　丁酸发酵制氢过程的末端产物主要是丁酸、乙酸、H₂、CO₂和少量丙酸。许多可溶性的碳水化合物（如葡萄糖、蔗糖、淀粉等）主要是以丁酸发酵为主。丁酸发酵产氢的反应方程式可以表示如下：

这些物质在严格的厌氧细菌或兼性厌氧菌的作用下，葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶催化作用下脱酸，羟乙基结合到酶的TPP（焦磷酸硫胺素）上，生成乙酰辅酶A，脱下的氢使铁氧还蛋白还原，而还原型铁氧还蛋白在氢化酶的作用下被还原的同时释放出。丁酸发酵产氢途径见图2-51。

以丁酸型发酵途径进行产氢的典型微生物主要有梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）等；其主要末端产物有丁酸、乙酸、CO₂和H₂等^［49］。

② 混合酸发酵　混合酸发酵产氢类型中，典型的微生物主要有埃希菌属和志贺菌属等，主要末端产物有乳酸（或乙醇）、乙酸、CO₂、H₂和甲酸等。其总反应方程式可以用下式来表示：

在混合酸发酵产氢过程中，由EMP途径产生的丙酮酸脱羧后形成甲酸和乙酰基，然后甲酸裂解生成CO₂和H₂。混合酸发酵产氢途径见图2-52^［49］。

③ 细菌乙醇发酵　乙醇发酵制氢是最近几年发现的一种新型制氢方法^［50］。其主要末端产物为乙醇、乙酸、少量的丁酸、H₂及CO₂。目前推测这一发酵类型的优势种群可能与细菌乙醇发酵种群有关。这种方法不同于典型的微生物代谢过程中的乙醇发酵。典型的乙醇发酵是碳水化合物经糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸经乙醛生成乙醇的过程。在此过程中，发酵产物为乙醇和CO₂，无H₂产生。乙醇型发酵制氢的途径主要是葡萄糖经糖酵解后形成丙酮酸，在经丙酮酸脱酸酶的作用下，以焦磷酸硫胺素为辅酶，脱羧变成乙醛，继而在醇脱氢酶作用下形成乙醇。过程中还原型铁氧还蛋白在氢化酶的作用下被还原的同时释放出。

所有产乙醇细菌的碳代谢都是经过葡萄糖发酵产生乙醇和CO₂，经过EMP途径发生脱氢脱羧反应，同时也产生其他的一些产物，如乙酸、氢、乳酸等，其中共同的产物是乙醇，不过乙醇的产生途径不同^［53］。厌氧发酵单胞菌，胃八叠球菌等严格厌氧菌，解淀粉欧文氏菌属等兼性厌氧菌发酵葡萄糖为乙醇时，与酵母菌是同一途径，即丙酮酸脱羧酶途径。经过如下反应：

自然界中具有丙酮酸脱羧酶的细菌并不多见。许多肠细菌类，和梭菌类细菌以及嗜热厌氧菌类的细菌形成乙醇时并不是丙酮酸脱羧酶作用来合成乙醛，而是以乙酰辅酶A作为乙醛的前体，由乙醛脱氢酶还原乙酰辅酶A为乙醛，经如下反应：

图2-53可看出两种乙醇产生途径的不同之处不仅仅在催化的关键酶不同，两种途径对NADH的消耗量也不同。

（2）黑体后甲酸裂解途径

兼性厌氧异养细菌利用细胞色素为电子供体和甲酸产氢被称为第二种途径产生菌。这类细菌有大肠杆菌（Escherichia coli）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloaca）、产气肠杆菌（Enterobactera erogenes）等，肠杆菌型（Coli-type）脱氢酶是其催化酶系。图2-54是其产氢过程。

甲酸裂解酶被丙酮酸在缺乏合适电子受体或缺氧的情况作用，脱羧形成甲酸和乙酰辅酶A，甲酸由甲酸脱氢酶和氢酶共同作用分解甲酸产生H₂和CO₂。目前对甲酸氢解酶的研究还不够成熟，其中必需元素硒和钼，同时铁元素是酶合成的结构元素，培养基中缺乏铁元素时，影响甲酸脱氢酶的合成。

（3）黑体后NADH+H⁺产氢途径

该途径是通过还原型辅酶Ⅰ（NADH+H⁺）的氧化还原平衡调节作用产氢，在碳水化合物发酵过程中，经EMP途径产生的NADH和H⁺可以通过与一定比例的丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等发酵过程相偶联而氧化为NAD⁺，以保证代谢过程中NADH/NAD⁺的平衡。为了避免NADH和H⁺的积累而保证代谢的正常进行，发酵细菌可以通过释放H₂的方式将过量的NADH和H⁺氧化，其反应方程式为：

ΔG=-21.84kJ/mol　　（2-34）

虽然在标准状况下，NADH+H⁺转化为H₂的过程不能自发进行，但是在NADH-铁氧还蛋白和铁氧还蛋白氢酶作用下，该反应能够进行。

对NADH产氢途径，Tanisho认为，产氢量与细胞中残存的NADH成正相关^［45］，推导出NADH计算公式为：

残留的NADH=产生的NADH-消耗的NADH

=2乙酸+2丁酸+丁二醇+4丙酮-琥珀酸-甲酸

该计算公式是在对产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）E.82005的研究中推论出来的。对于不同的发酵途径而言，糖酵解时产生NADH的途径基本相似，但是消耗NADH的途径并不相同。NADH产氢的假定模式如图2-55所示^［54］。

由于末端产物产生途径中有消耗NADH的过程，不可能所有的NADH都用来产氢。因此这个模式中体现的是扣除所有的被消耗的NADH，所剩余的NADH被氢酶氧化产生H₂分子的过程。

2.4.2　生物制氢的微生物及其关键酶

2.4.2.1　光合产氢微生物

光合生物产氢按照其分解底物的不同又可分为藻类和光合细菌类两大类。其中，藻类（如蓝藻和绿藻）主要依靠分解水来产生H₂，而光合细菌则主要依靠分解有机质来产生H₂。光合微生物能够利用太阳能产生H₂。

（1）黑体后藻类

蓝藻（又称蓝细菌）是一种原核生物，它可以利用太阳能还原质子产生H₂。如：多变鱼腥藻（Anabaenavariabili）、柱孢鱼腥藻（A.cylindrica）、球胞鱼腥藻（Anabaena sp.）、满江红鱼腥藻（A.azollae）、钝顶螺旋藻（Spirulinaplatensis）、珊藻（Scenedesmus）、聚球藻（Synechococcus）、沼泽颤藻（Oscillatorialimnetica）、点形念珠藻（Nostocpunctiform）等^{［55，56］}。研究表明，鱼腥蓝细菌属的蓝细菌生成H₂的能力远远高于其他蓝细菌。特别地，丝状异形胞蓝细菌（A.cylindrica）和多变鱼腥蓝细菌（A.variabilis）具有很高的产氢能力，具有开发前景。

真核绿藻如莱因哈德衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）、绿小球藻（Chlorellalittorale）、蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa C-101）、斜生栅藻（Scenedesmusobliquus）、杜氏盐藻（Dunaliellasalina）^{［57，58］}等也具有产氢能力。表2-18为对不同国家目前微藻制氢研究现状的分析^［59］。

（2）黑体后光合细菌

光合细菌（photosynthetic bacteria，PSB）是一群没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，具有固氮能力，它们的共同特点是能在厌氧和光照条件下进行不产氧的光合作用。它属于原核生物，只含有光系统PSⅠ，电子供体或氢供体是有机物或还原态硫化物，主要依靠分解有机物产氢。自从Gest首次在Science报道光合细菌可利用有机物光合产氢之后^［60］，人们便相继发现了众多的产氢光合细菌。产氢光合细菌主要集中于以下几个属。

红假单胞菌属：红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）的产氢光合细菌有球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphaeroides）的一些菌株、Rp.sphaeroides，Rp.spheaeordes，Rp.sphaeroides等；荚膜红假单胞菌（Rp.capsulatus）的一些菌株，Rp.cap.ATCC23782，Rp.capsulatus等；绿色红假单胞菌（Rp.viridis）；红假单胞菌菌株D；嗜酸红假单胞（Rp.acidophila）；沼泽红假单胞菌（Rp.palustris）等。

外硫红螺菌属：外硫红螺菌属（Ectothiorhodospirace），如空泡外硫红螺菌（E.vacuola）可以利用丙酮酸作为碳源产氢。

其他的光合细菌还有红微菌属（Rhodomicrobium）；小红卵菌属（Rhodovulum）；着色菌属（Chromatium）的酒色红硫菌（C.vinosum）；红螺菌属（Rhodospririllum）的深红红螺菌（R.rubrum）；荚硫菌属（Thiocapsa）的桃红荚硫菌（Th.roseopersicina）^［61］。

20多年来，关于利用光合细菌进行生物制氢的研究，各国的研究者们一直进行着不懈的努力。然而，氢生产率和对太阳能的转化效率仍然较低，诸如氢产率低和产氢代谢过程的稳定性差等问题，始终是制约光合生物产氢技术发展的主要障碍，有待于进一步研究解决。

2.4.2.2　发酵产氢微生物

发酵产氢微生物主要是一些不需要光照，主要以分解有机物为产氢提供能量的一些细菌。发酵产氢微生物主要包括专性厌氧发酵产氢菌、兼性厌氧发酵产氢菌和需氧发酵产氢菌。

（1）黑体后专性厌氧发酵产氢菌

它们不具有细胞色素体系，通过产生丙酮酸或丙酮酸的代谢途径来产氢。包括梭菌属（Clostridium）、甲基营养菌（Methylotrophs）、产甲烷菌（Methanogenicbacteria）、瘤胃细菌（Rumenbacteria）以及一些古细菌（Archaea）等^{［62，63］}，脱硫菌（Desulfovibriodesulfuricans）是唯一具有细胞色素体系的专性厌氧菌。

这些严格厌氧发酵菌可以用于单独放氢，也可以进行混合放氢。它们能够分解利用多种有机质放氢，如可以利用木糖、树胶醛糖、半乳糖、纤维二糖、蔗糖和果糖等小分子糖类，也能利用纤维素和半纤维素等大分子糖类放氢^［64］。

进行丁酸型发酵制氢的菌类主要是一些厌氧菌，主要优势种群是梭菌属（Clostridium），如丁酸梭状芽孢杆菌（C.butyricum）等。丁酸梭菌发酵葡萄糖生成丁酸、乙酸、H₂和CO₂的过程如图2-56所示。该菌的代谢是存在热动力学效率调节的产物途径。ATP产量并不与葡萄糖分解呈化学计量。观察到的ATP产量为3.3molATP/mol葡萄糖。梭菌型产氢菌代表的丁酸梭菌产氢途径中具有两个产氢位点，分别在三磷酸甘油醛脱氢产生的NADH氧化产氢，和丙酮酸脱氢酶系作用下，丙酮酸脱氢脱羧产生时偶联氢酶产生氢。

瘤胃细菌生存在动物的瘤胃中，利用动物未完全消化的有机物作为产氢的底物。如白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）可以分解糖类产生可以分解糖类产生。发酵葡萄糖的产氢代谢途径如图2-57所示。

该菌的代谢途径属于细菌乙醇发酵，产物只有乙酸、乙醇、H₂和CO₂。产物中乙酸比乙醇要多很多。厌氧菌代表的丁酸梭菌和白色瘤胃球菌的产氢途径比较相似，二者都是梭菌型产氢机制的产氢菌。在热动力学调节的产物途径对产氢的调节下，不同的只是消耗NADH的产物。丁酸和乙醇分别作为消耗NADH的一种途径。因此，热动力学效率对微生物代谢的调节作用直接影响到微生物的产氢能力。

产甲烷细菌在厌氧的情况下有一定的放氢能力，在正常情况下，其主要产物仍然是甲烷；但在甲烷生成受到抑制的时候，巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcinabarkeri）可以利用CO和H₂O，生成H₂和。

（2）黑体后兼性厌氧发酵产氢菌

含有细胞色素体系，能够通过分解甲酸的代谢途径产氢。包括大肠杆菌（Escherichiacoli）、肠道细菌（Enterobacter）和柠檬酸杆菌（Citrobacte）^{［67，68］}等。

兼性厌氧条件下大肠杆菌通过混合酸发酵途径发酵葡萄糖，通过甲酸氢解酶系产氢。肠杆菌科（Enterobacter）的很多细菌也都是通过甲酸氢解酶产氢。如阴沟肠杆菌（Enterobactercloaca）和产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）都是这种类型。图2-58描述了大肠杆菌厌氧条件下的葡萄糖代谢和产氢途径。

大肠杆菌代谢产生的甲酸在厌氧和缺乏合适电子受体情况下，由甲酸氢解酶复合物裂解转化为CO₂和H₂，属于非产能反应，受O₂、和甲基蓝（methyl blue，MB）的抑制。甲酸氢解酶复合物有合适电子受体如硝酸或者延胡索酸存在时，生成的还原力可以还原硝酸和延胡索酸，产生ATP。各种氧化条件下的大肠杆菌的产氢反应和氢化反应见图2-59。

大肠杆菌有极高的生长率，能够利用多种碳源，而且产氢能力不受高浓度H₂的抑制，但是其缺点是产氢量比较低。

（3）黑体后需氧发酵产氢菌

它们只能在有氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以O₂作为最终氢受体。需氧放氢微生物主要包括有芽孢杆菌（Bacillus）、脱硫弧菌（Desulfovibrio）和产碱菌（Alcaligenes）等^［69］。

2.4.2.3　氢酶的研究

能够产氢的微生物都含有氢酶（hydrogenas），氢酶是产氢代谢中的关键酶，它催化氢气与质子相互转化的反应，在微生物能量和氢代谢中起着关键作用。1931年，Stephenson和Stickland首次在大肠杆菌中发现了氢酶^［70］。1974年Chen等^［71］首先从巴氏梭菌中分离纯化了可溶性氢酶，随后有多种氢酶从不同微生物中被分离纯化。

目前发现的氢酶按照所含金属原子种类可以分为四种：［NiFe］氢酶，［NiFeSe］氢酶，［Fe］氢酶和不含任何金属原子的metal-free氢酶^［72］。［NiFe］氢酶和［Fe］氢酶研究较多，已经有晶体结构出现。［NiFe］氢酶分为吸氢酶和放氢酶，广泛存在于各种微生物中。典型的产氢细菌具有［Fe］氢化酶。［Fe］氢酶催化产氢的活性比［NiFe］氢酶高100多倍，对氧非常敏感。研究最多的是梭菌和绿藻的［Fe］氢酶。

Michael等研究了巴氏梭菌，描述了糖氧化产氢的电子传递过程（图2-60）。丙酮酸氧化后电子通过Fd（铁氧还蛋白，含有两个Fe₄S₄），然后传递给氢化酶，到达H簇，至少要经过七个Fe-S簇^［73］。

蓝细菌吸氢酶和可逆氢酶都是［NiFe］氢酶。吸氢酶存在于所有固氮的单细胞和丝状蓝细菌中。吸氢酶与膜相结合，在一些丝状蓝细菌中仅在异形胞中表达，在营养细胞中没有或仅有极少活性。吸氢酶至少由约60k和35k的两个亚基（HupL和HupS）组成。吸氢酶对氢的回收具有三方面功能：通过氧氢反应（Knallgas反应）提供ATP；去除O₂，保护固氮酶免于失活；为固氮酶和其他细胞活动提供电子。在丝状蓝细菌中，吸氢酶和固氮酶具有密切的联系。

2.4.2.4　固氮酶

固氮酶是和生物产氢联系最紧密的一种酶，也是一种多功能的氧化还原酶。固氮酶是由钼铁蛋白和铁蛋白组成的复合体，这两种蛋白单独存在时都不呈现固氮酶活性，只有两者形成复合体才具有还原氮的能力^［74］。存在于能够发生固氮作用的原核生物（如固氮菌，光合细菌和藻类等）中，能够把空气中的N₂转化生成或氨基酸。固氮酶的活性直接影响光合细菌的氢产率。氧气对固氮酶的活性有强烈的抑制作用，极微量的氧就足以使其钝化失活，因此到目前为止也仅有少数光合细菌的固氮酶被分离。铵和铵盐的存在既抑制固氮酶的活性，又抑制固氮酶的合成^［75］。

固氮酶对氧极其敏感，主要由两个亚基组成：固氮酶（nitrogenase，MoFe-蛋白，或蛋白Ⅰ）和固氮酶还原酶（dinitrogenase reductase，Fe蛋白或蛋白Ⅱ）^［76］。固氮酶是一个α₂β₂异源四聚体，称为MoFe-蛋白，在整个固氮催化的过程中，以连二亚硫酸盐为还原剂。α亚基和β亚基分别由nifD和nifK编码。光合细菌的固氮酶是一种铁硫蛋白。大亚基含有2个钼，20～30个铁，以及20～30个硫。相对分子质量为130k。固氮菌和蓝藻的相对分子质量为（220～240）k。固氮酶还原酶由nifH编码，是一个同源二聚体，主要调节电子从电子供体（铁氧化还原蛋白或黄素氧化还原蛋白）向双向固氮酶还原酶传递。光合细菌的固氮酶还原酶含有4个铁和4个硫，相对分子质量为33.5k左右。而蓝藻为（60～70）k。

2.4.3　生物制氢工艺及利用

固体废物生物法制氢时，可借鉴废水生物制氢反应器运行的经验。由于发酵液中存在细小的固体颗粒物，设计反应器、选择生物载体时应充分考虑颗粒污泥与固体废物颗粒物的分离问题。固定床反应器（接触滤池）^［77］、浸出床反应器^［78］都已成功地用于处理有机固体废物制氢。

2.4.3.1　光合制氢技术

由于光合菌具备能源自立式转化系统，可以汇集和利用太阳光和有机废物等大量分散的能源，具有较高的理论转化率，通过代谢产生清洁新能源H₂，终产物中H₂组成可达到95%以上。该技术是将太阳能利用和环境治理结合起来的可再生能源生产技术，环境效益、社会效益和经济效益显著。光合细菌生物制氢技术只需常温常压的操作环境，具备实现规模化生产的前景，正在成为当前生物制氢研究的热点。

（1）黑体后固定化技术

固定化光合细菌是通过一定的技术手段将光合细菌固定在载体上，使其高度密集并保持生物活性，避免菌体流失，在适宜条件下能够快速、大量增殖并提高菌体利用率的方法。固定化光合细菌解决了非固定化制氢工艺中存在的光合细菌流失和固液分离困难的问题。采用细胞固定化技术，在一定程度上可提高反应器内的生物持有量，使单位反应器的产氢率和运行稳定性有所提高，并利于实现产氢的连续化。另外，微生物细胞经固定化后，其产氢酶系统的稳定性提高，连续产氢能力增强，具有浓度易控制、耐毒害能力强、菌种流失少、产物易分离、运行设备小型化等特点。光合细菌的固定需要依附于一定的载体材料，适用于光合细菌固定的载体材料很多，但是性能不一。根据所固定光合细菌种类的不同和固定化方法的不同，需要选用或制备不同的固定化载体材料。固定化载体材料主要有三大类：无机载体、有机高分子载体和复合载体。用于制备固定化细胞的方法种类繁多，常见的固定化方法有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。除常见的固定化方法外，最近挂膜法也引起了人们的重视。但是，固定化技术的复杂性、巨大的工作量，以及高昂的制氢成本决定了该技术的应用只能局限于小型的实验室研究，无法实现大规模的工业化生产。而且作为固定化载体的基质会占据反应器内大量的有效空间，反应器比产氢率的进一步提高会由于生物持有量不足而受到限制。

（2）黑体后光合生物反应器

光合细菌生物制氢反应器是用于光合细菌大规模培养并产氢的装置。保持反应器中光合细菌的生理活性和代谢稳定性，实现连续，稳定和高效的产氢。由于光合细菌产氢需要在厌氧光照的条件下进行，这就要求光合制氢反应器除是一个相对密闭容器外，其结构形式还要满足光照的要求。目前光合制氢反应器按照结构形式可分为管式、板式、箱式、螺旋管式和柱式等几种结构形式。

管式反应器是最早开发的光合细菌制氢反应器，也是结构最简单的反应器之一。反应器一般由一支或多支尺寸相等透光管组成，为了最大可能地增加采光面积，反应器一般采用圆管形式。目前已研制有单管式、列管式、正弦波浪管式等形状的光合细菌制氢反应器。管式反应器通体材料既作为采光面又作为结构材料，导致反应器容积受加工材料限制，反应器温度不易控制，占地面积大，反应液在管内的流动阻力大，反应器寿命受色素累积及材料老化等外界因素的影响。图2-61为环管式光合制氢反应器，该反应器由10支直管通过U形接头连接而成，每支长2m，内径48mm，其有效工作容积53L^［79］。

螺旋管式反应器是一种特殊的管式反应器，解决了单管或列管式反应器只能利用反应管的一侧作为采光面导致光能利用率低的问题。图2-62是一种内布光式的盘绕管光合制氢反应器。图2-63是澳大利亚Murdoch大学研制的螺旋管式光合细菌制氢反应器，反器由柔性透明管沿螺旋方向旋转围绕而成，该反应器容积达到1m³。对于螺旋管反应器来说，由于螺旋管的长度过大，无形中增加了反应液的流动阻力，驱动能耗成为一个关键问题，同时由于盘绕支架本身的结构问题不易使用较大管径的绕管，其运行中的温度控制也同样是不容忽视的问题。

　

　

板式反应器一般采用硬性材料作骨架，仅使用透光材料作采光面，非采光面可以使用强度较高的材料制作同时还可以进行保温处理，避免了管式反应器采光面同时作为结构材料所造成的容积受限和控温等问题。通过减少反应器厚度和采用双侧光照使反应器采光面积与容积比有了很大提高。目前已研制有单板式、多板叠合式、嵌槽式、网格板式等形式的反应器。图2-64是爱尔兰Semastiaan Hoekema研制的一种带气体循环搅拌的板式光合制氢反应器，该反应器采用不锈钢框架，采光面采用三聚碳酸酯材料，反应器有效工作容积为2.4L^［80］。板（箱）式反应器的主要缺点是：a.由于受光线透过性的影响，反应器厚度不能太大，造成反应器容积受限；b.不易实现温度控制；c.光能利用率和光能转化率低；d.反应器内溶液混合性差。

　

柱状光合细菌制氢反应器是在管式反应器的基础上进行的改进设计，通过多级串联或并联实现大容积反应器的开发。目前已研制了单柱式、双柱式及多柱回流等几种形式光合制氢反应器。图2-65是荷兰研制的单柱式反应器，反应器由有机玻璃制成，直径20cm，高2m，总容积为65L^［81］。柱状光合细菌制氢反应器存在的主要问题是：a.柱体直径同样受限于光在反应液中穿透性；b.反应器的高度受加工材料限制；c.光能利用效率低；d.温度不易控制；e.反应器运行寿命受色素沉积和菌体吸附影响。

　

其他类型的反应器还有瓶状反应器、内置光源反应器等。瓶状反应器主要是基于增大反应器光照表面积，同时通过缩小反应器高度可以容易实现反应温度控制进行研制的。内置光源反应器一般采用人工光源供光或通过使用光导纤维导入自然光和设置石英发光体为反应器提供光源。内置光源形式使光源向四周的辐射光能都能被利用，提高了反应器的光能利用率。

目前光合细菌制氢反应器的研究还处于初级探索阶段，其研究水平和规模还基本局限在实验室水平。

2.4.3.2　发酵制氢技术

利用发酵微生物制取H₂的原料来源广泛，现有的发酵制氢工艺以有机废水和有机固体废物为主。有机废水主要有含有单糖、二糖以及多糖的有机污染水体，如糖蜜废水、蔗糖生产废水、酿酒废水以及淀粉生产废水等。有机固体废物如木质纤维素、餐厨垃圾、粪便等。

（1）黑体后木质纤维素类发酵制氢技术^［82］

木质纤维素生物质是一种潜在的低成本原料，如农作物秸秆、木屑等，通常含有38%～50%的纤维素、20%～35%的半纤维素和15%～25%的木质素，其中纤维素和半纤维素可转化为发酵性糖用于H₂生产。但由于木质纤维素结构复杂，利用木质纤维素中纤维素和半纤维素生产H₂时需要一些额外的工序，如预处理、脱毒处理和生产水解酶类等。图2-66是以木质纤维素为原料，转化为H₂的主体工艺流程。

① 木质纤维素的预处理技术　木质纤维素中纤维素由木质素和半纤维素包裹着，纤维素与半纤维素或木质素分子间的结合主要依赖于氢键；半纤维素和木质素之间除氢键外还有化学键合。半纤维素是无定形组分，含木糖、阿拉伯糖、葡萄糖等多种结构单元，易于水解；木质素和半纤维素对纤维素的包覆作用及结晶纤维素致密结构引起的反应惰性，都使纤维素酶水解严重受限。因此，需要对原料进行预处理以去除部分或全部木质素，溶解半纤维素，或破坏纤维素的晶体结构，从而减小聚合度，增加孔隙度和表面积等，以促进酶与底物相互接触并反应，提高酶解速率和得糖率。预处理方法归纳起来包括物理法、物理化学法、化学法和生物法。目前，用于木质纤维素预处理发酵产氢的研究主要是采用化学方法预处理和物理化学方法预处理。

机械粉碎是常用的物理预处理方法，它能使颗粒变小，降低结晶度，对处理高结晶度和高度木质化的材料都有较高的效果。此外粉碎处理后得到的粉料具有较高的容积密度，有利于增加酶反应的底物浓度，提高酶的作用效率。粉碎处理的方法中，以球磨尤其是振荡球磨的效率更高，高温下研磨比在常温下研磨的效果更好。如果在研磨时加入少量膨胀剂或木质素溶剂亦可以提高研磨的效果。但物理法具有耗能大、成本高、生产效率低的缺点，因此研究较少。

化学法是采用酸、碱、次氯酸钠、臭氧等试剂进行预处理，其中以碱和稀酸预处理研究较多。碱预处理是利用木质素能够溶解于碱性溶液的特点，碱预处理操作简便，设备要求较低。使用较多的碱有NaOH、KOH、Ca（OH）₂和NH₃等。用碱预处理天然木质纤维素可破坏其中木质素的结构，显著提高后续酶水解效率。碱处理法的机制在于OH^-能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键以及皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键。稀NaOH可引起木质纤维原料的膨胀，结果导致内部表面积增加，聚合度降低，结晶度下降，木质素和碳水化合物之间化学键断裂，从而破坏木质素结构。碱预处理相对于酸法成本较低，操作安全，但仍需废水和残余物的回收处理工序。稀酸预处理通常采用0.5%～2%的H₂SO₄，在110～220℃下处理一定时间。由于半纤维素被水解成单糖，残余物形成多孔或溶胀型结构，从而促进了酶解效果。在稀酸预处理条件下，半纤维素转化成可进一步发酵的单糖，有利于资源的充分利用。但木质素依然保留在固体残渣中，对后续酶水解步骤会有一定的不良影响。

物理化学方法有蒸汽爆破法、CO₂爆破法、氨纤维爆破法。木质纤维素原料在高压水蒸气或氨水中经过短时间加热后，快速地释放压力至大气压，此过程使纤维结构严重膨化破坏，从而促进后续的酶水解过程。氨纤维爆破法是蒸汽爆破法与碱处理法的结合，即将木质纤维原料在高温和高压下用液氨处理，然后突然减压使原料爆破。利用NH₃爆破处理具有很多优点：不用机械粉碎将纤维素物料粒径变小；木质素除去后，大部分的半纤维素和纤维素可以保留下来得以充分利用；不会产生发酵抑制物，水解液可以不用处理直接发酵微生物；NH₃可以回收，残留的铵盐可以作为微生物的营养物。

生物法预处理是指利用一些微生物分解木质素的特性，有效地去除缠绕在纤维素外围的木质素外鞘，增大其与纤维素酶的接触面积，从而提高纤维素和半纤维素的酶解糖化率。普遍认为分解木质素的菌类有白腐菌、褐腐菌和软腐菌。微生物处理法具有无污染、耗能低、经济效益高的优点，但目前存在的微生物种类较少，木质素分解酶类的酶活低，培养菌种的时间长，并且某些白腐菌降解木质素的同时也会损失掉部分的纤维素和半纤维素，故而发展较慢，尚不能工业化应用。

② 木质纤维素发酵液产氢关键技术　利用木质纤维素水解物发酵产氢研究中主要有两个关键点：首先，如何解除木质纤维素预处理水解过程中产生的抑制物质对发酵的抑制作用；其次，木质纤维素水解产物包括戊糖（木糖、阿拉伯糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）多种糖的混合物，如何高效利用戊糖己糖混合糖进行发酵产氢。

木质纤维素原料在高温高压和催化剂预处理（水解）过程中会形成多种发酵抑制物质，如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等。由于这些抑制物质对微生物的生长代谢有抑制作用，从而使水解液中糖发酵生成H₂受到严重限制。因此，需要采用高效、经济的方法去除或减少木质纤维素水解液中的抑制性物质。目前，关于木质纤维素水解液抑制成分的脱除方法已有多种报道，如活性炭吸附、负压蒸发、加碱、离子交换、微生物降解或酶解法。其中效果较好的是离子交换法，但该方法成本高，不宜在大规模生产中使用。碱法是指用碱将pH值调到10然后再调到发酵所需pH值，这是目前对水解液抑制成分脱除使用最多的一种有效方法，但该方法产生大量沉淀，使水解糖液中的糖损失较大，操作复杂，因此实际应用有一定难度。负压蒸发可去除挥发性抑制剂，但该方法在大规模生产应用中受到限制。活性炭吸附是一种廉价、有效的方法，所以对活性炭吸附脱除抑制成分做了较多研究，包括pH值、温度、接触时间、活性炭浓度对脱除抑制成分的影响等。微生物或酶法降解抑制性物质，目前仍处于研究阶段。

木质纤维素水解产物中富含戊糖（木糖、阿拉伯糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖）等混合糖。其中己糖较容易被微生物利用，目前关于能够利用己糖发酵产氢的微生物已有很多报道，且已获得了一些产氢能力较高的菌株。相比之下，水解液中的戊糖较难被微生物利用。如果仅将水解液中的己糖部分进行较高程度的利用，产生的H₂相对于木质纤维原料的利用率也不超过40%，只有将水解液中戊糖、己糖全部转化成H₂，才能获得较高的经济效益。因此，如果找到能同时利用戊糖和己糖产氢的微生物可大大提高水解液的利用效率，降低成本。近年来，研究者们陆续开展了一些关于戊糖发酵产氢及同步发酵戊糖己糖混合糖产氢的相关研究。

③ 纤维素生物制氢工艺　随着对纤维素原料生物转化生产清洁能源的不断研究，先后有学者提出纤维素生物转化的工艺过程，包括分步水解发酵（separate hydrolysis and fermentation，SHF）、同步糖化发酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）、同步糖化共发酵（simultaneous saccharification and co-fermentation，SSCF）和联合生物加工工艺（consolidated bio processing，CBP）等工艺方案。以上各种方法分别在酶的产生与提供、纤维素水解、水解物发酵过程等方面存在一定的差异（图2-67），这些差异也将导致纤维素产氢的效率有所不同。

分步水解发酵（SHF），是将纤维素酶法或微生物法水解糖化与利用糖化液发酵制氢分步进行的方法。在这一过程中，反应或发酵条件可独立控制完成，糖化或发酵更为准确，针对性更强。在混合培养体系中，最佳酶解条件与最佳生长或产氢条件会有所不同，可能导致单方面限制产糖或产氢效率，从而降低纤维素转化效率和产氢量。因此，为更好地进行高效率生产，单独水解和方法被很多学者所采用^［83］。在分步水解发酵过程中，产物的形成也受多种因素的限制，如末端产物的反馈抑制，在糖化过程中产生的葡萄糖过量会抑制葡萄糖苷酶的活性，纤维素酶也会被纤维二糖和葡萄糖所抑制。此外，低细胞浓度以及高浓度基质也会抑制发酵过程。

分步水解发酵（SHF）从木质纤维素化学转化演变而来，即用酶解纤维素产生还原糖，进而再利用糖进行发酵。纤维素的酶解和酶解液的发酵分别在不同的反应器中进行。鉴于纤维素酶解糖化存在成本较高、酶活性及酶转化率不稳定等诸多问题，因此逐渐有人采用具有糖化功能的菌株或复合菌系对纤维素进行糖化，再进行产氢发酵^［84］。与纯菌株相比，复合菌系同样可以应用于纤维素的糖化过程，利用复合菌系进行糖化与利用酶相比，反应体系更为稳定，不易受环境影响，再利用纯菌发酵糖化产物产氢可取得较好效果。但在糖化过程中，产糖效率不及酶糖化明显。

同步糖化发酵（SSF），即纤维素的酶水解糖化过程与厌氧产氢发酵同步进行。目前，很多学者利用糖化微生物而非直接添加酶进行糖化，并与产氢微生物进行联合培养，称为同步糖化共发酵（SSCF）。以上两种同步糖化发酵的方法，微生物糖化及发酵过程在同一体系内进行，纤维素糖化产物很容易迅速被产氢微生物所利用，解除其对糖化反应的反馈抑制。同步糖化发酵，较大程度上简化了发酵设备，缩短了纤维素物质转化周期，提高了转化率^［85］。因其具有设备投资成本较低，生产能耗低等工业化优势，越来越受到人们的重视，也是目前较为流行的纤维素生物转化产氢的工艺方法。同步糖化发酵方法与分步糖化发酵法相比，有效提高了生产效率，降低了生产与设备成本，但纤维素酶解过程与产氢发酵过程在发酵条件、发酵周期、发酵速率等方面的不统一性，一直是限制该方法研究与应用的主要因素。

直接微生物转化（direct microbial conversion，DMC），又可称为联合生物加工工艺（CBP），是一种将纤维素酶的产生过程与糖化、产氢发酵集合在一个反应体系内同步进行的生产工艺，同时也是一种将纤维素直接利用转化为H₂的生产工艺。尽管该工艺也需要对木质纤维素原料进行一些预处理，但与以上几种方法相比，该工艺较大程度地降低了生产过程的能量消耗，有效地降低了生产成本。因此，它正成为第3代能源生产过程中非常经济而又受关注的目标^［86］。

（2）黑体后餐厨垃圾发酵制氢技术

餐厨垃圾有机物含量极高，在去除动物骨头、餐巾纸、筷子等少量杂质之后，挥发性固体与总固体含量的比值（VS/TS）达到90%以上，十分容易被生物降解。此外，餐厨垃圾营养成分丰富，配比均衡，是十分理想的厌氧发酵底物。

目前利用混合餐厨垃圾作为底物用以产氢的研究日益增多，主要目的在于综合各类因素，培养合适的混合菌种，研究最佳工艺控制条件和最大转化效率，证实餐厨垃圾发酵产氢的可行性，相关的研究结果见表2-19^［87］。

影响餐厨垃圾生物制氢的主要因素有温度、pH值、底物种类和浓度、金属离子、氧化还原电位（ORP）、水力停留时间（HRT）、反应器类型、C/N等，这些因素对厌氧产氢都有一定的影响。由于餐厨垃圾的组成复杂，每种组分如淀粉、蛋白质、脂肪等都需要特定的外界环境以及微生物条件才能获得最佳产氢效果，因此，餐厨垃圾来源不同，接种物质不同，产氢过程需要控制的条件不同。

此外，将餐厨垃圾与活性污泥混合厌氧发酵产氢，可以提高产氢效率。对于产氢菌来说，有机氮源如蛋白胨或酵母膏是很好的营养源，而铵盐或尿素则效果不佳，污泥是富含蛋白质的有机废物，在餐厨垃圾中加入污泥能够提高系统的C/N，增加产氢菌的氮源营养物质，因此H₂产量会得到大幅度提高。

（3）黑体后粪便发酵制氢技术

畜禽粪便中含有大量可用于发酵产氢的微生物，还含有大量的未被消化吸收的有机物质（纤维素、半纤维素、蛋白质等）及微生物生长代谢过程所必需的N、P等营养物质，可提供厌氧发酵制氢微生物生长所需的营养物质，如将其作为制氢原料，既可得到清洁能源H₂，又可实现废物的资源化。

2.4.3.3　其他发酵制氢技术

（1）黑体后暗-光偶联发酵制氢技术

暗发酵处理废物除产氢外，还产生大量的有机酸，其出水中的有机酸可用于光发酵制氢，因此开发出先经过暗发酵再进行光发酵的制氢技术，比单独使用一种方法制氢具有很多优势，可有效提高H₂的产量。暗-光发酵不仅显著提高氢气产率，还可去除水中的有机酸。暗发酵处理城市有机固体废物制氢时，产生的有机酸和醇，以获得维持自身生长所需的能量和还原力，解除电子积累而快速释放部分H₂。由于产生的有机酸不能被暗发酵细菌继续分解而大量积累，导致暗发酵细菌产氢效率低下，成为暗发酵细菌产氢大规模应用面临的瓶颈问题。而暗发酵产生的小分子有机酸是光发酵制氢的理想原料，消除有机酸对暗发酵制氢的抑制作用，进一步释放H₂，其产氢速率甚至高于人工基质^［88］。同时光发酵细菌不能直接利用纤维素和淀粉等大分子的复杂有机物，对廉价的废弃的有机资源的直接利用能力和产氢能力差。所以，充分结合暗-光发酵两种细菌各自的优势，将两者偶合到一起形成一个高效产氢体系，不仅可以减少光能需求，而且可以提高体系的产氢效率，同时还可以扩大底物的利用范围。适当控制介质的成分和环境，联合两个系统可获得较高的H₂产率。暗发酵的出水中存在有色物质、氨等，在光发酵制氢前需经预处理。此外，应适当稀释、中和暗发酵出水，调整各种营养物浓度，使有机酸浓度、pH值、C/N等有利于光发酵制氢^［89］。因此形成光合细菌和厌氧细菌的混合的高效产氢体系，如图2-68所示^［90］。

（2）黑体后暗发酵和微生物电解电池的组合

利用生物质进行碳中性-可持续的生物制氢，还可通过微生物电解产氢技术完成^［91］。典型的微生物电解产氢装置是微生物电解池（microbial electrolysis cell，MEC），其工作原理为：生长在MEC阳极表面的产电微生物（无需外源电子介体而具有胞外电子传递能力微生物的统称，exoelectrogens），主要是产电细菌，氧化有机物产生电子、质子和CO₂，电子被阳极收集后通过外电路到达阴极，在那里与质子结合产生H₂（图2-69）^［92］。

MEC的阳极反应与微生物燃料电池（microbial fuel cell，MFC）相同，阴极反应与电解水产氢一致。MFC一般以O₂作为在阴极的电子受体，而O₂得电子的氧化还原电位比阳极反应的高，因而外电路中电子的流动是自发的。而在MEC中，阴极上质子还原的氧化还原电位比阳极反应的低，电子是不能自发流动的。为了克服此能量壁垒，使析氢反应得以进行，需外加一个理论值为0.13～0.14V的电压（表2-20）^［92］。在实际反应中，由于过电位的产生，此外加电压一般在0.3～0.8V，但仍小于电解水产氢过程中所需的电压（1.8～2.0V）。通过MEC从生物质中产氢，获得的氢能与所输入的电能的比值往往介于100%～400%。多出输入电能的这部分能量即为MEC从生物质中获取的能量收益。

发酵法制氢最大的局限就在于将底物转化为H₂的效率较低，这实际上造成了生物质的大量浪费，如果能将发酵产物继续转化为H₂将大大提高获得的H₂产率。虽然MEC能直接利用可发酵底物（如糖类）产氢，但往往给电极微生物群落带来较大的代谢压力，导致：a.发酵细菌大量增长，造成底物（电子供体）损失，同时减少产电菌在电极上的比例，造成电子由底物向电极转移效率的下降；b.有机酸在发酵过程中的积累，导致MEC中pH值的下降，最终给产电菌带来不可逆的破坏；c.发酵底物产氢，将给其他非产电微生物（如甲烷菌）提供电子供体，造成底物的损失，从而导致MEC H₂产率的下降。因此，可将MEC置于暗发酵制氢后端，使二者作为一个体系梯级产氢。对于更复杂的生物质，如秸秆、林业废物、城市污水厂剩余污泥和牲畜粪便等，对其的直接发酵产氢效率较低，这时发酵可作为一种生物预处理手段，以产生可溶性小分子有机物，然后再通过MEC强化作用回收H₂。

暗发酵制氢发酵类型有丁酸型和乙醇型，前者发酵产物主要以丁酸为主，伴有乙酸和其他一些有机酸的产生；后者以乙醇和乙酸为主要发酵产物。乙酸、乙醇和丁酸都可作为MEC的底物，其中乙酸最容易被产电菌利用，产氢效果最佳。乙醇作为一种可发酵有机物，能被产电菌直接利用或者在反应器中经过发酵转化为乙酸后被利用，因此也是MEC非常理想的底物。而丁酸在MEC中的表现相对较差。目前，研究者对MEC的认识和研究尚处于初级阶段，和MFC一样，对MEC的研究主要集中在开发新构型和廉价阴极材料上，目的是通过这些研究减少能量损失和提高产氢速率。

（3）黑体后厌氧发酵产氢阶段与产甲烷阶段的组合

厌氧发酵产氢阶段与产甲烷阶段的组合也能有效地提高H₂产量。在第1阶段（产氢阶段），H₂通过产氢菌在低的pH值条件下被生产出来；在第2阶段（产甲烷阶段），产氢阶段的残留液被产甲烷菌在中性条件下利用以产生传统的燃料甲烷。Liu^［93］以家庭固体废物为底物，采用厌氧发酵产氢阶段与产甲烷阶段的组合培养方式，成功地进行了产氢和产甲烷试验。

2.4.4　生物制氢存在的问题

虽然生物制氢技术有着广阔的前景，但是，它也存在着基质种类单一、利用率较低、发酵产氢微生物不易获得和培养等问题。发酵法生物制氢技术距离大规模的工业化生产还有很大的距离，尚有很多关键性的技术问题没有很好的解决，制约着该项技术的工业化进程。提高系统的产氢效率和运行稳定性，降低生产成本是生物制氢技术实现工业化的根本问题。

2.4.4.1　高效生物制氢微生物的筛选及育种

优良的菌种是生物制氢成功的首要因素，也是制约生物制氢技术工业化的重要问题之一。光能转化效率低下问题一直困扰着广大研究者。为了适应工业化的生产，筛选优良产氢菌种是提高生物制氢产量，降低成本的最基本和直接的方法，由于菌种筛选工作量大，任务繁重，所以目前此类菌种系统筛选方面所做工作较少，而且菌株的产氢能力有限，这都严重制约了生物制氢产业化的进程。运用基因工程手段改造光发酵细菌的光合系统或人工诱变获取高光能转化效率的光发酵产氢菌株，深入研究光能转化机制包括光能吸收、转化和利用方面的机制，提高光能的利用率，以加快生物产氢的工业化进程。

无论是纯种还是混菌培养，提高关键菌株产氢效率都是最重要的工作。条件优化手段已经不能满足这一要求，需要运用分子生物学的手段对菌种进行改造，以达到高效产氢的目的。概括起来，菌种改造可以涉及如下几个方面。a.运用代谢工程手段等现代生物技术对产氢细菌进行改造的研究目前在生物制氢领域还没有展开，是很值得深入研究的方向。b.对产氢过程关键酶——氢酶的改造，如同源、异源表达氢酶以强化产氢过程。除此之外，由于产氢细菌内的氢酶种类繁多，基因敲除的方法也是一个可行策略。另外，通过蛋白质工程对氢酶进行强化，包括增加其活性、耐氧性也都是可行策略。c.扩大底物利用范围。不仅仅依赖于筛选能够降解不同底物的产氢菌株，通过基因工程在目标菌株中表达降解不同生物体高分子的酶，也是将来一个重要的手段。

2.4.4.2　发酵产氢工艺条件优化

产氢工艺条件的优化研究是生物制氢试验中研究最多的方面，工艺条件的研究主要集中为确定特定菌种产氢的最佳环境参数。由于不同的菌种要求的生长条件各不相同，不同的研究者采用的菌种不同，使用的产氢基质不同，所以需要首先确定各自研究对象产氢的最佳工艺条件。工艺条件的优化研究主要包括培养基成分、温度、pH值、氮源种类和添加量、接种量、菌龄等各方面的内容。但是对于其中的科学机制尚没有细致研究，仅依靠pH值、水力停留时间、接种来实现过程的控制。

发酵产氢工艺中产氢的稳定性和连续性问题一直是困扰产氢工业化的一个很大障碍。科学家们正试图通过菌种固定化、酶固定化技术来解决。特别是在产氢酶的固定化技术这方面的突破，必将加速产氢的工业化进程。

2.4.4.3　产氢方法的研究

目前生物制氢的研究主要集中在两大方面，即利用简单底物的纯培养和复杂底物的混合培养，这两种方法各有利弊。简单底物的纯培养虽然可以提高产氢收率，但是一般很难利用较复杂的底物产氢，即使有的细菌可以利用经过预处理的复杂底物产氢，但效果一直不太理想。这都不利于生物制氢的产业化大规模发展。另外，复合菌种由于组成复杂，现有的条件很难对其进行彻底的了解和充分利用其中每一个种群的功能，而且由于操作条件的小幅度变化都会导致体系的失衡和功能的变化，缺乏功能稳定性，当出现不稳定情况时，一般很难恢复，加大了操作的难度，同样也不适应生物种群的大规模生产应用，这就需要对现有的、可操作的和已基本掌握的微生物进行合理有效的组合，明确使用目的和使用范围，在最优的工艺条件下发挥其最佳的产氢能力。

2.4.4.4　混合细菌发酵产氢过程中彼此之间的抑制、发酵末端产物对细菌的反馈抑制等

暗发酵生物制氢虽然具有产氢稳定、速率快等优点，但是，由于挥发酸的积累而产生反馈抑制作用限制了其产氢量。有机废水存在许多适合光合生物与发酵型细菌共同利用的底物。理论上可以实现在处理废水的同时利用光合细菌和发酵细菌共同制取H₂，来提高产氢的效率。但是，实际操作过程中发现，混合细菌发酵产氢过程中彼此之间的抑制、发酵末端产物对细菌的反馈抑制等现象的存在使得效果不明显甚至出现产氢效率偏低的问题^［94］。

2.4.4.5　暗-光发酵偶合系统的协同及系统的生态共融性问题

暗-光发酵两种细菌在生长速率、酸的耐受力等方面存在巨大差异，而且暗发酵产酸速率快，致使体系pH值急剧下降，严重抑制光发酵细菌的生长，产氢效率降低，这也是混合培养产氢的瓶颈问题。如何使二者充分利用各自优势，发挥互补功能，解除彼此间的抑制及产物的反馈抑制，提高H₂生产能力、底物转化范围和转化效率，是亟需解决的问题。需要研究者不断地分离筛选同一生态位的光发酵和暗发酵细菌或改进产氢条件，优化产氢系统，使二者能够更好地发挥协同产氢作用，使之能够在同一系统中共存，实现真正意义上的底物的梯级利用，深度产氢^［95］。

2.4.4.6　成本过高

成本问题制约了生物制氢技术的工业化应用。廉价底物的开发利用对降低生物制氢的成本至关重要。重点开展以工农业废水、城市污水、畜禽废水等可再生资源以及秸秆等含纤维素类生物质为原料进行暗发酵和光发酵产氢的研究，既可降低生产成本又可净化环境。

2.4.4.7　对环境的不利影响

发酵制氢结束后剩余废液中仍然含有大量挥发性脂肪酸和脂肪醇，如乙酸、丙酸、丁酸、乙醇、丁醇等，这样的液体还需要进一步处理，才能达到排放标准。此外目前普遍采用的产氢菌驯化培育方式无法抑制H₂S产生，不但对环境造成影响，而且降低了产氢潜力，易腐蚀仪器设备。

2.4.5　生物制氢发展方向

人类赖以依存的化石能源将消耗殆尽，而H₂正是目前最理想的清洁燃料之一。目前，氢燃料汽车、氢燃料电池等都是以H₂作为化石能源的替代品。人类对氢燃料的需求也将越来越多，石油、化工、电力、化纤等行业都大量使用氢，强大的市场需求必将加快H₂工业产业化发展的步伐。H₂必将成为后化石燃料时代的能源主要供应方式之一。H₂作为能源是现代经济与可持续发展的需要。目前，从煤、石油和天然气等化石燃料中制取H₂已初具规模，但从长远观点看，不符合可持续发展的需要。成本高是生物制氢技术没有产业化的主要问题，我国可用于生物制氢的原料非常多，如利用工业废物、城市污水、生活垃圾、动物粪便等有机废物以及秸秆等含纤维素类生物质发酵制氢，可大大降低生产成本。暗-光发酵偶合生物制氢技术可将废水处理、太阳能利用和清洁能源生产三者有机结合，并形成一种新型的环保企业。因此，无论从环境保护，还是从新能源开发、可持续发展的角度来看，发酵法生物制氢技术都具有很大的发展潜力。今后生物转化产氢研究的主要发展方向有以下几个方面。

2.4.5.1　加大生物制氢微生物资源及产氢过程的研究

纯菌种生物制氢规模化面临诸多困难，而且自然界的物质和能量循环过程，特别是有机废水、废弃物和生物质的降解过程，通常由2种或多种微生物协同作用。因此，利用微生物进行混合培养或混合发酵产氢已越来越受到重视。大规模选育能同步发酵戊糖、己糖产氢微生物及直接转化纤维素产氢的微生物，优化产氢工艺条件，建立最佳的共降解生物质废物产氢菌群，可提高原料利用效率和目标产物收率。由于在有机废水发酵制氢过程中，将有大量有机挥发酸相伴而生，导致生物介质的pH值降低，选育和使用耐酸的产氢发酵菌种，可节约甚至完全节省因pH值调节对碱的大量需求，从而使制氢成本降低^［96］。

相互作用关系，实现对过程的有效、智能控制。核心问题是不同细菌、不同菌群之间的代谢迁移机制。现代分子生物学的发展为研究这一问题提供了可能，目前已采用FISH、DGGE、SSCP等方法用于分析产氢污泥中的细菌分布，微生物群落的演替变化、功能微生物的定量和定性分析也将推动对这一问题的解析。目前的代谢网络构建往往只集中在单一细菌中，如何研究和有效利用菌群的代谢网络也将是一个重要的科学问题。

2.4.5.2　建立固体废物的定向高效产氢生物技术

开发多种微生物细胞固定化、微生物耐受逆境的生物技术，增强微生物对生物质废物水解液中抑制成分的耐受能力，提高产氢稳定性，实现高产氢速率、产氢量和连续稳定的生物制氢过程；开发吸附、中和等方法减少或消除代谢物中抑制物的抑制作用，结合多种高效、无污染、低成本的预处理方法，针对不同类型的生物质进行处理。探索高效的预处理方法、优化预处理工艺。

2.4.5.3　开发规模化生物制氢工艺

目前国内研究均处于由小试向中试过渡的阶段。光发酵生物制氢技术的研究程度和规模还基本处于实验室水平，暗发酵生物制氢技术已完成中试研究^［97］。制氢设备的小型化在一定程度上严重制约了产氢工业化的进展。研制可以达到工业化生产规模的制氢设备，显得尤为重要。

为进一步提高产氢能力，提高基质利用率和多目标产物收率，多目标联合/偶合工艺模式值得推行。如暗发酵-光发酵偶合、暗发酵-微生物电解产氢工艺偶合、产氢-产甲烷工艺偶合等。