3 动态膜片钳
动态钳（dynamic clamp）是一种以膜片钳技术为基础，将计算机数字模拟系统、放大器、活细胞三者合而为一的电生理记录方法，目前主要用于记录可兴奋细胞的固有电活动以及注入外在模拟电流后膜电位的变化情况。关于动态钳的应用最早可追溯至上世纪70年代末期美国科学家Scott对鸡胚胎心室细胞的研究；其后，伴随计算机信息技术的高速发展，动态钳理论及设备不断更新改进，逐渐在心血管生理学等研究领域得到广泛应用。本文拟对动态钳的基本原理及优缺点进行简述，并结合延迟整流钾电流（delayed rectifier potassium current，IKr）说明动态钳在心脏电生理研究中的应用。
一、动态钳基本原理
动态钳主要由计算机数字模拟系统（digital dynamic clamp system）、膜片钳放大器（amplifier）、活细胞（living cell）三部分构成（图1-3-1）。正式记录前，需在计算机数字模拟系统中采用Hodgkin-Huxley、FitzHugh-Nagumo、Luo-Rudy等模型设置特定离子通道（如IKr）、突触结构（如缝隙连接）等的电生理学相关参数，如电导（g）、时间常数（τ）、半数有效激活电压（V0.5A）、半数有效失活电压（V0.5I）等。动态钳实验中电信号的输入与输出经由同一个玻璃微电极介导完成—当玻璃微电极与细胞形成经典的全细胞膜片钳记录模式后，即可通过膜片钳放大系统采集、记录细胞膜电位（Vmyo）变化情况，并输入至计算机数字模拟系统；该系统根据心肌细胞电压（Vmyo）以及已设置的相关电生理参数实时计算电流（Iinj）并输入细胞，从而实现对细胞的动态钳制。
二、动态钳记录的基本类型
尽管动态钳概念及技术的形成、发展较短，但其在心脏电生理学及神经生理学等领域的应用仍旧十分广泛，并逐渐衍生、形成多种记录模式。在心脏电生理研究中，经典的动态钳记录类型包括3种，即耦合钳（coupling clamp）、模型动态钳（model dynamic clamp）及动作电位钳（action potential clamp）。
图1-3-1 动态钳基本构成及原理模式图
1.耦合钳
该构型是一种细胞间记录方法，是最早被用于心脏电生理研究的动态钳模式。其采用双膜片钳技术，在电流钳模式下同时记录两个活细胞的膜电位并将其输入至同一个计算机数字模拟终端；系统计算出细胞间的电位差后求得相应电流，并通过放大器分别注入细胞。
2.模型动态钳
在模型动态钳模式下，放大器采集单个细胞的膜电位变化情况并输入计算机数字模拟系统，后者根据内设的某种附加电导模块持续、实时地向前者施予命令电压，从而实现向细胞注入外加电流。
3.动作电位钳
应用动作电位钳时，需首先在电流钳模式下记录细胞的动作电位波形（action potential waveforms，APW），并将该过程中细胞膜电位的变化情况传输至计算机数字模拟系统；后者可拟合出APW的过程，当记录模式切换至电压钳时，即以命令电压形式输入细胞并记录相应电流，记为总电流（control Im）。之后，加入拟研究的离子通道等的特异性阻滞剂，记录用药后的膜电流，记为残余电流（compensation Im）。总电流与残余电流之差即为该离子通道介导的电流。此时，可结合模型动态钳模式，在持续予阻滞剂阻断内源性离子通道的前提下，观察由计算机数字模拟系统发出刺激产生上述离子电流对动作电位的作用，并可分析改变g、V0.5A、V0.5I等参数时动作电位变化情况。
三、应用动态钳研究IKr对心肌复极及其变异影响
IKr是由hERG基因编码的钾通道介导的离子电流，在心肌细胞动作电位的复极化（尤其是平台期后期）过程中起重要作用。IKr异常相关参数的变化对于评估心律失常的风险性具有重要意义。近年来，动态钳技术在心血管电生理研究领域的应用越来越多，促进了对特定离子通道在心脏电活动作用及影响的认识，并为明确临床疾病病因、寻求潜在治疗方法提供了可靠的技术支撑及理论依据。下面简要说明动态钳在研究IKr对心肌复极及其变异影响中的应用。
1.通过动态钳设置IKr数字模型电流代替心肌细胞内源性的IKr
将动态钳刺激周长设为1秒，设置IKr数字模型电流（mIKr）代替心肌细胞内源性的IKr，通过系统设置mIKr各项参数，从而改变动作电位间期（APD）及其短轴（SD1）。结果显示E4031特异性阻断IKr后显著延长了APD，且仅使SD1增大，从而SD1/SD2也变大。说明特异性阻断IKr能显著增大APD变异性的快速成分。输入mIKr完全逆转了E4031对动作电位和SD1的改变（图1-3-2）。
2.动作电位及其变异性的相关性研究
一般认为，SD1与平均APD成一定的比例相关性。为了查明这种比例相关性是否随IKr阻滞而消失，而随mIKr输入又能恢复，就在上述三种实验条件下（对照组，E4031和mIKr组）记录分析SD1值，根据相应的APD平均值画出对应的相关性直线（图1-3-3A），然后进行回归残差分析（图1-3-3B），显示残差在对照组和mIKr组是阴性，而在E4031组是阳性且较大，说明在IKr阻滞条件下，SD1以一定偏离的方式依存于APD。SD1和APD相关性在不同条件下也不相同。虽然回归斜率在三组没有到达统计学差异，但回归截距在对照组和mIKr组相似，而在E4031组截距较大（图1-3-3C），说明在IKr阻滞条件下，SD1要比所预期的依存平均APD的数值要大得多。然而mIKr输入后恢复到对照组水平，所以通过这个分析显示稳定的IKr影响有必要建立在数字模型中IKr的电流属性。
图1-3-2 mIKr电流输入逆转了E4031对动作电位的影响
A：对照组（a，黑线），E4031灌注组（b，红线），和mIKr电流输入组（c，蓝线）的代表性动作电位图形。红色和蓝色显示了mIKr电流输入后逆转了E4031对动作电位的延长。B：三种不同条件下记录的动作电位校准后的图形，图中显示了动作电位间期（APD）和SD1的平均值；右侧为平行对应的Poincare散点图。C：在三种实验条件下APD，SD1和SD1/SD2的统计学分析柱状图。（P<0.05；*与对照组比较，†与E4031组比较）
图1-3-3 APD与SD1相关性
A：三种实验条件的数据散点图，采用总体回归线分析；B：从图A中计算出回归残差；C：每个实验条件下各自回归线的数据分析。APD指动作电位；SD1指动作电位短轴变异性
3.应用动态钳改变mIKr相关参数对APD及其变异性的影响
IKr是电压依赖性hERG钾通道电流，即其激活与失活主要受膜电位调控。上述研究结果发现IKr与APD及其变异性快速成分密切相关，那么改变IKr相关参数如其激活、失活动力学特性或时间常数等对APD、SD1等影响如何呢？以对照组所记IKr的最大电导（gmax）、V0.5A、V0.5I、τ等为参照，观察在E3041阻断内源性IKr后、改变mIKr上述参数后心肌细胞动作电位APD、SD1、SD1/SD2的变化情况。
（1）改变mIKr的gmax：
以对照组IKr为参照，上调（或下调）gmax可使mIKr的振幅（Ipeak）以及达到最大幅值时的电压值（Vpeak）发生相应地增加（或减小）。另外，尽管上调gmax可使APD轻度下降，但这种改变并不具有统计学意义；增加gmax亦对APD变异性即SD1等无显著影响。下调mIKr的gmax值虽可使SD1、SD2均显著增加，但不影响动作电位APD及SD1/SD2（图1-3-4）。
图1-3-4 改变mIKr的gmax对动作电位的影响
A：对照组（黑线），下调gmax（红线），和上调gmax组（蓝线）APD变化情况。B：三种不同条件下记录的动作电位校准后的图形，图中显示了动作电位间期（APD）和SD1的平均值；右侧为平行对应的Poincare散点图。C：三种实验条件下动作电位代表图及相应IKr随时间或刺激电压变化情况：上调、下调gmax可使mIKr的振幅及所需刺激电压相应增加或减小。D：在三种实验条件下APD，SD1和SD1/SD2的统计学分析柱状图。（P<0.05；*与对照组比较）
（2）改变mIKr的V0.5A及V0.5I：
如图1-3-5所示，V0.5A向去极化方向移动可使mIKr的Ipeak显著减小，并使Vpeak更正。同时，V0.5A的这种改变尽管不影响APD，却可增加SD1、SD1/SD2从而影响动作电位变异性。而使V0.5A向超极化方向移动对mIKr振幅以及APD、SD1、SD1/SD2均无显著作用。
此外，无论是V0.5I向去极化方向还是向超极化方向移动，均可显著改变mIKr的Ipeak、Vpeak、APD及SD1等参数。V0.5I向去极化方向移动时，mIKr的Vpeak亦明显正向移动，伴Ipeak显著增大、APD缩短及SD1减小。V0.5I发生超极化改变时作用相反（图1-3-6）。
图1-3-5 改变mIKr的V0.5A对动作电位的影响
A：V0.5A改变示意图。对照组（黑线），V0.5A向超极化方向移动（红线），和V0.5A向去极化方向移动（蓝线）。B：三种条件下APD变化情况。C：三种不同条件下记录的动作电位校准后的图形，图中显示了动作电位间期（APD）和SD1的平均值；右侧为平行对应的Poincare散点图。D：三种实验条件下动作电位代表图及相应IKr随时间或刺激电压变化情况：V0.5A向去极化方向移动可使mIKr的振幅及所需刺激电压减小。D，在三种实验条件下APD，SD1和SD1/SD2的统计学分析柱状图。（P<0.05；*与对照组比较）
（3）改变mIKr的时间常数τ：
改变时间常数后APD、SD1等的变化情况见图1-3-7。减小τ除可使mIKr的Vpeak稍右移外，其他相关参数均不发生明显改变。另外，增加τ对Ipeak、Vpeak及APD、SD1等均无明显影响。
上述研究结果表明，IKr的半数有效失活电压V0.5I改变时对APD及SD1等的影响最为显著，即可推测IKr对动作电位复极化及变异性的影响主要与IKr的失活过程密切相关。另外，与APD相比，SD1对IKr其他参数的改变亦更为敏感，因此认为，SD1在发现与IKr相关复极异常等心律失常方面较APD更具优势。
图1-3-6 改变mIKr的V0.5I对动作电位的影响
A：V0.5I改变示意图。对照组（黑线），V0.5I向超极化方向移动（红线），和V0.5I向去极化方向移动（蓝线）。B：三种条件下APD变化情况。C：三种不同条件下记录的动作电位校准后的图形，图中显示了动作电位间期（APD）和SD1的平均值；右侧为平行对应的Poincare散点图。D：三种实验条件下动作电位代表图及相应IKr随时间或刺激电压变化情况：V0.5I向去极化、超极化方向移动可使mIKr的振幅及所需刺激电压分别增加、减小。D，在三种实验条件下APD、SD1和SD1/SD2的统计学分析柱状图。（P<0.05；*与对照组比较）
四、动态钳技术的局限性及应用展望
动态钳强调对细胞的实时钳制，因此放大器及计算机数字模拟系统对电信号采集、处理速度应十分迅速；同时它对计算机硬件及软件配置要求也甚高。此外，动态钳往往用于模拟某种离子通道从而研究该通道介导的离子电流对细胞兴奋性的影响。但值得注意的是，细胞是包括多种离子通道、蛋白及生物信号通路等的有机整体；目前，动态钳技术仅关注电信号变化，因此细胞其他生物化学变化及其引起的电生理改变并不能通过动态钳记录研究。
尽管动态钳技术存在上述不足，但该技术在心脏电生理中的广泛应用将有助于进一步明确心律失常等疾病的病因、指导制定疾病治疗方案，对离子通道相关疾病（如IKr相关QT延长综合征）的研究具有重要意义。
图1-3-7 改变mIKr的τ对动作电位的影响
A：τ改变示意图。对照组（黑线），τ减小组（红线），和τ增大组（蓝线）。B：三种条件下APD变化情况。C：三种不同条件下记录的动作电位校准后的图形，图中显示了动作电位间期（APD）和SD1的平均值；右侧为平行对应的Poincare散点图。D：三种实验条件下动作电位代表图及相应IKr随时间或刺激电压变化情况。D：在三种实验条件下APD、SD1和SD1/SD2的统计学分析柱状图
（郑明奇 朱梦叶 李春）
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