7　钠通道蛋白1.5亚型

钠通道蛋白1.5亚型（Nav1.5）由SCN5A基因编码，是心脏组织中存在的主要钠通道的α亚基，形成了钠离子流流动的主要孔道。SCN5A基因突变涉及长QT综合征（long QT syndrome，LQTS）、Brugada综合征（Brugada syndrome，BrS）、致心律失常性右室心肌病（arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC）、心脏传导障碍、婴儿猝死综合征（sudden infant death syndrom，SIDS）等。Nav1.5并非单独存在，其与多种蛋白结合，参与组成“大分子复合物”而发挥效应。这些与Nav1.5结合的蛋白即为互作蛋白，互作蛋白也被称为辅助蛋白、附属蛋白、衔接蛋白、相关蛋白、效应蛋白、调节蛋白、锚定蛋白和支架蛋白等。互作蛋白的命名尚无明确的定义，在多方面对Nav1.5通道具有调节作用，包括通道的活性，通道在细胞的准确定位。

一、Nav1.5通道结构

Nav1.5是一个由2016个氨基酸组成的糖基化膜蛋白，分子量为220kD。它包括4个同源结构域（DⅠ～DⅣ），每个结构域包括6个跨膜片段（S1～S6）（图1-7-1）。其中S1～S4构成电压感受区域（voltage-sensing domain，VSD），S4跨膜片段具有一些带电荷氨基酸残基，参与通道激活，S5及S6构成孔道形成区域（pore-forming domain，PD），这个区域决定了钠离子的选择性通透（图1-7-2）。每个同源结构域均通过连接环（IDⅠ-Ⅱ，IDⅡ-Ⅲ和IDⅢ-Ⅳ）与相邻结构域相连。3个连接环结构以及通道的N末端和C末端均位于胞质内，失活门控开关与IDⅢ-Ⅳ环及C末端结构相关。

二、Nav1.5通道在心肌细胞膜上的分布特征

有效蛋白表达-功能关联研究发现，Nav1.5通道在内质网合成后，沿其分泌途径进入高尔基体进行加工、分类与包装，再自高尔基体沿微管转运系统向细胞膜迁移。新近研究显示，Nav1.5通道在细胞膜并非均匀分布，而是集中在心肌细胞的闰盘、侧膜和T管处表达。不同区域分布的钠通道具有不同的生理特性及功能。大部分钠通道分布在闰盘处，细胞端闰盘Nav1.5通道库，约占总钠通道的50%，这些钠通道与缝隙连接一起，负责细胞间动作电位的传播。心肌细胞闰盘是一个相互作用组的承载体，即一个与细胞兴奋性，增殖和细胞间连接相关的蛋白质相互作用网络。而相互作用组的主体结构为机械连接（包括黏附连接和桥粒），缝隙连接和电压门控钠离子通道复合物（voltage-gated ion channel，VGSC），三者主要负责细胞间的连接，电偶联和细胞兴奋性。细胞侧膜Nav1.5通道，约贡献30%的钠电流，与闰盘处钠通道相比，具有较小的峰电流幅值，电压依赖性稳态失活表现出了明显的负移。另一部分Nav1.5通道分布在T管，主要负责激活电压依赖性的钙通道（图1-7-3）。

进一步，Agullo-Pascual等应用扫描膜片钳及超分辨率显微镜发现，在成熟心室肌细胞膜的不同部位，Nav1.5通道蛋白以>20个离子通道的形式聚集成簇存在，簇与簇之间没有通道分布。Lin 等也发现钠通道桥粒蛋白（plakophilin 2，PKP2）突变仅选择性地引起闰盘处峰钠电流降低，却不引起侧膜钠电流改变，诱发BrS。Baba等也发现在犬心肌梗死后的瘢痕组织细胞上，侧膜的钠电流降低>50%，而细胞末端钠电流不变。Lin等发现，细胞侧膜和闰盘处钠通道分布不同，门控动力学各异，侧膜峰电流远低于闰盘，且其半失活电压更负。

三、互作蛋白与Nav1.5通道功能调控

截至目前，已发现近20种互作蛋白参与Nav1.5通道功能调控。按照功能可分为负责通道迁移及锚定到细胞膜上特定部位的锚蛋白（如ankyrin-G、SAP97），通过翻译后修饰与通道发生相互作用并调节通道功能的酶（如nedd4-2、CaMKⅡ）以及通过与Nav1.5结合而调节其通道门控特性的蛋白（如ZASP、Telethonin）等。按照与Nav1.5的结合部位可分为结合于Nav1.5通道C末端结构域的蛋白（如SAP97、α1-syntrophin），结合于胞内或胞外连接环结构的蛋白（如ankyrin-G、MOG1），结合于Nav1.5通道N末端结构域的蛋白（目前暂无明确证据发现结合于此部位的互作蛋白）以及目前结合部位尚不明确的蛋白（如caveolin-3、GPD1L等）。按照疾病相关性可分为BrS相关蛋白（如ankyrin-G、MOG1），LQTS相关蛋白（如α1-syntrophin、caveolin-3）及SIDS相关蛋白（如α1-syntrophin、GPD1L）等。

（一）SAP97

SAP97对于闰盘Nav1.5通道的形成与功能至关重要。SAP97属于膜相关鸟苷酸激酶支架蛋白家族成员，参与细胞表面离子通道的锚定与聚集过程。在牵出实验中，Petitprez等发现无论是小鼠心脏裂解物还是人类心房组织，SAP97都通过SIV结构域与Nav1.5结合于C末端PDZ结合域，而这种相互作用只存在于闰盘处。SAP97沉默可导致表达Nav1.5的人胚胎肾（HEK）细胞以及大鼠心肌细胞钠电流密度明显降低，以此揭示了SAP97/Nav1.5相互作用对钠通道功能的影响，而正是由于SAP97/Nav1.5相互作用的破坏，导致了细胞膜表面Nav1.5表达的降低。与上述实验方法不同，Gillet等选择心脏特异性敲除SAP97的小鼠进行研究，却发现了意外的结果，Nav1.5在闰盘处的定位以及钠电流均未受到SAP97缺失的影响。此现象可能解释为：细胞间信号分子在不同类型的细胞可能具有差异，或者在细胞分离过程中出现了结构重组。此外，Milstein等认为，SAP97不仅参与了闰盘钠通道复合体的组成，也可能是Nav1.5、Kir2.1和SAP97这个大复合体的组成成员。而SAP97对于这个复合体的完整性以及Nav1.5-Kir2.1相互作用是至关重要的。然而，目前尚无SAP97突变与临床中Nav1.5离子通道疾病发生的相关性报道。

（二）ankyrin-G

ankyrin-G是一种细胞内支架蛋白，可将VGSC复合体连接于细胞骨架。免疫共沉淀方法证实，大鼠心肌细胞与HEK293细胞中，ankyrin-G均与Nav1.5存在共定位。脊椎动物钠通道有一个保守的ankyrin结合域，使得ankyrin直接结合于Nav1.5 DⅡ-Ⅲ连接环上。在大鼠心肌细胞中，通过siRNA技术敲低ankyrin-G后，Nav1.5总表达、细胞膜定位及钠电流均降低，但通道动力学并未发生改变。说明ankyrin-G沉默可导致大部分Nav1.5向细胞膜的迁移过程发生障碍，另一种推测认为ankyrin-G作为支架蛋白，可以在Nav1.5转运到细胞膜后将其维持在膜上并阻止细胞内吞作用。进一步，有学者指出ankyrin-G可调控闰盘处信号平台而实现在体调控心脏兴奋性。该研究中发现ankyrin-G一方面协助Nav1.5定位到心肌细胞闰盘，另一方面通过βⅣ spectrin将CaMKⅡδ定位到闰盘处进而通过磷酸化修饰对Nav1.5通道蛋白功能进行调节，同时发现心脏特异性敲除ankyrin-G的小鼠表现出明显的室性心律失常及传导障碍。临床上，ankyrin-G与BrS的发生密切相关，BrS患者中发现的SCN5A-E1053K点突变发生在一个高保守区域，且此位点恰好位于ankyrin-G结合域，该突变阻碍了SCN5A与ankyrin-G之间的相互作用，导致钠电流的降低。更重要的是，该突变导致Nav1.5通道蛋白不能正确定位到心肌细胞膜上，提示ankyrin-G对Nav1.5通道蛋白迁移至关重要。

（三）dystrophin/syntrophin

细胞侧膜钠通道是dystrophin-syntrophin-Nav1.5复合体的组成部分。Nav1.5通过衔接蛋白syntrophins与dystrophin 发生相互作用。牵出实验首次证明了此相互作用通过SIV结构域实现，结合于Nav1.5通道蛋白的C末端PDZ结合域，并且此复合体仅存在于心肌细胞侧膜。Dystrophin缺陷的小鼠，Nav1.5蛋白表达下降50%，钠电流密度降低30%，并在ECG中观察到传导障碍。因此认为，细胞侧膜Nav1.5的表达及功能依赖于Nav1.5与dystrophin 和syntrophin之间的相互作用。Petitprez等进一步证实了上述结论，发现了dystrophin/syntrophin与Nav1.5在心肌细胞侧膜的共定位，dystrophin缺陷鼠的心肌细胞中Nav1.5仅在侧膜出现特异性表达降低，而上述现象在细胞闰盘均未发现。临床中发现，编码α1-syntrophin的SNTA1的突变与LQTS和SIDS的发生相关。通过对39名LQTS患者进行基因筛查发现了A257G-SNTA1错义突变存在于3名患者中，而在400名健康对照者中均未发现此突变。携带该突变的SNTA1与Nav1.5共同表达于HEK293细胞或乳鼠心肌细胞时，激活曲线负移，峰钠电流密度增加。另一个突变位点A390V可破坏神经元型一氧化氮合酶/4b型细胞膜钙泵/syntrophin/Nav1.5复合体，增强Nav1.5通道蛋白亚硝基化作用进而增加晚钠电流。

（四）utrophin

utrophin与dystrophin具同源性，并通过相同的方式与Nav1.5结合。在dystrophin缺陷鼠中，utrophin上调，提示当dystrophin缺陷时，utrophin可对dystrophin缺陷起到补偿作用，进行代偿反应。而对dystrophin和utrophin进行双敲除后，细胞表面Nav1.5蛋白表达、钠电流密度及动作电位最大上升速率的改变均较dystrophin敲除鼠更加明显。

（五）connexin 43（Cx43）

早期研究发现，心律失常小鼠的缝隙连接蛋白Cx43表达明显降低，且与Nav1.5蛋白表达下调、传导减慢及离散度增加一致。提示Cx43和Nav1.5下调共同增加了传导障碍和心律失常的易感性。在大鼠心肌细胞中Cx43下调可致钠电流幅值明显减低，这提示Cx43介导的微管稳定性，在闰盘处功能性钠通道大分子复合物的形成中发挥重要作用。近来随着影像学技术的迅速发展，Agullo-Pascual等通过超分辨率显微镜在纳米级水平对Nav1.5通道蛋白簇的定位进行观察，研究中发现携带Cx43的378-382位点缺失型突变的小鼠心室肌细胞中，细胞末端功能性Nav1.5通道蛋白簇聚集显著减少而导致了钠电流的降低。

（六）桥粒蛋白

PKP2是一种桥粒蛋白，是负责心肌细胞间连接的重要分子。Sato等发现缺失PKP2的心肌细胞中，钠电流显著降低。并且PKP2的表达缺失可导致细胞与细胞间接触区域Nav1.5明显减少，折返活动增加以及传导速率显著降低。在PKP2缺失的小鼠心房肌细胞肿瘤细胞系（HL-1细胞）及多能干细胞诱导的心肌细胞中，同样可观察到钠电流幅值降低。有学者选择PKP2-Hz小鼠模型进行研究，拟通过在体实验方式揭示ARVC的可能发病机制。该小鼠模型并未表现出结构性心肌病，其心室肌Nav1.5蛋白表达水平也并无改变，但其心室肌细胞钠电流幅值却显著降低。此外，与野生型心肌细胞相比，钠通道门控动力学特性也明显改变，该实验首次在体证明了PKP2对于Nav1.5通道功能调控的重要性。除PKP2外，Rizzo对另一桥粒相关蛋白desmoglein-2的研究发现，对其突变Dsg2-N271S在小鼠心肌细胞进行过表达，观察到了钠电流密度显著降低，心室激活时间延长以及传导速率降低。

（七）MOG1

MOG1为核蛋白Ran鸟嘌呤核苷酸的释放因子，主要分布于心室肌细胞的闰盘处，与Nav1.5通道DⅡ和DⅢ结构域之间胞质侧loopⅡ结合，主要参与Nav1.5通道的迁移和闰盘处的定位。新生鼠心肌细胞过表达MOG1导致钠通道在细胞膜表达上调。MOG1是BrS发病相关的重要蛋白之一。MOG1突变不改变钠通道门控过程，但通过下调细胞膜Nav1.5通道蛋白的表达，引起峰电流50%降低，并诱发BrS。Chakrabarti等发现，敲低小鼠心室肌细胞的MOG1，可使Nav1.5通道在细胞膜上定位发生偏离，通道向非小窝区域转移，且电流几乎消失。该研究进一步发现，SCN5A-F1743R突变导致钠通道蛋白的迁移障碍可以被过表达的MOG1拯救，提示MOG1对于该突变引起的BrS具有潜在治疗作用。

（八）Nedd4-2

很多不同的离子通道都可以受到泛素化调节，泛素化是一种转录后修饰，可以使目标蛋白降解或转运。Nedd4-2泛素蛋白连接酶可与Nav1.5的C末端的PY结构域直接结合，对哺乳动物细胞钠通道进行泛素化。Abriel及相关学者证明，Nav1.5在细胞膜表面的内化过程受到Nedd4-2调节。Nedd4-2与Nav1.5共表达可导致峰钠电流降低，这恰好与细胞膜通道密度降低相关。并且心脏组织中Nedd4-2与Nav1.5相互作用正是依赖于Nav1.5 C末端PY结构域的完整性实现的。他们同样观察到了依赖于Nedd4-2的Nav1.5通道的泛素化现象。以上这些结果说明Nedd4-2可调节细胞膜表面Nav1.5通道表达密度，然而其具体机制尚未明确。

（九）GPD1L

GPD1L与Nav1.5的共定位现象及相互关联已通过免疫共沉淀和牵出实验分别得到证实。临床研究发现GPDL1突变分别与BrS及SIDS的发生均密切相关。BrS相关GPDL1突变A280V或另外3个SIDS相关GPDL1突变（E83K，I124V，和R273C）与Nav1.5共表达于HEK293细胞时，均可致钠电流降低超过50%。上述SIDS相关突变表达于小鼠心肌细胞时可显著增加晚钠电流。而A280V突变可使细胞表面钠通道表达下降接近30%。GPD1L作为一个代谢通路相关酶，如何针对Nav1.5发挥作用，目前有两种推测，一种推测为：A280V-GPD1L导致3-磷酸甘油及下游二酰甘油增多，进而上调Nav1.5/GPD1L复合物附近PKC，PKC通过钠通道磷酸化可降低钠电流。另一种推测为：通过PKC对线粒体的作用增加活性氧（ROS）生成，而ROS通过非特异性的机制降低钠电流。GPD1L与Nav1.5的共定位，功能方面的互作效应，以及遗传学方面的关联从多角度提示了GPD1L调节Nav1.5通道以及心脏兴奋性方面的重要作用。

（十）caveolin-3

caveolin-3是一种在骨骼肌和心脏高表达的小分子蛋白，是胞膜窖caveolae的重要结构蛋白。caveolae是细胞表面50～100nm大小的凹陷，它参与细胞的胞吞、胞饮作用、胆固醇的转运和信号转导，是细胞的信号处理中心，具有广泛的抑制信号转导的作用，富含各种信号分子和离子通道。在心肌细胞中，caveolin-3通常定位于细胞侧膜和T管膜。在大鼠心肌细胞中，通过免疫共沉淀均可检测出caveolin-3与Nav1.5的结合，然而其具体结合部位目前仍未明确，且caveolin-3可通过G蛋白调节肾上腺素能介导的心肌细胞钠电流。临床中LQT9及SIDS患者的发病均证实与caveolin-3突变相关。其中LQT9相关突变F97C和S141R在HEK293细胞中与Nav1.5共表达时均可增加晚钠电流，增加动作电位时程。在SIDS人群中发现的caveolin-3突变V14L，T78M和L79R同样具有增加晚钠电流的作用。由于caveolin-3可抑制nNOS，因此可以认为caveolin-3功能丧失引发nNOS抑制，进而增加Nav1.5通道亚硝基化作用，增加晚钠电流。这种效应可被NOS抑制剂消除。说明caveolin-3突变可能通过释放nNOS抑制剂，调节Nav1.5亚硝基化作用而影响晚钠电流。

（十一）calmodulin（CaM）

CaM是一种广泛表达的钙离子结合蛋白，参与多种细胞过程。多项研究中均发现了CaM与Nav1.5通道蛋白的C末端IQ结构域（具有一致性序列IQxxxRxxxxR）可直接结合，但是这种直接相互作用的功能学结果在各项研究中却并不一致，例如其对稳态失活的降低、增加以及无影响等效应均有发现。这些不一致的结果可能由于物种，表达系统以及实验方案的差别所导致。近期，Potet F及其团队又发现了CaM除结合于Nav1.5通道C末端外，还可与Nav1.5通道蛋白DⅢ-Ⅳ连接环结合，CaM通过这两种结合方式均可影响Nav1.5通道的失活。

（十二）CaMKⅡ

CaMKⅡ是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可使细胞内钙离子增加进而促进多种蛋白的磷酸化过程。CaMKⅡ可通过磷酸化修饰对Nav1.5通道功能进行调节。在心脏组织中CaMKⅡ与Nav1.5存在共定位及共沉淀现象。Ashpole发现CaMKⅡδc可结合于Nav1.5通道蛋白的DⅠ-DⅡ连接环，而且Ser-516和Thr-594残基可能是CaMKⅡδc的磷酸化位点。CaMKⅡ受到抑制可导致钠通道的稳态失活曲线负移，慢失活状态的延迟恢复，进而导致动作电位上升速率降低。而CaMKⅡδ过表达可延长QRS时限。此外，有研究发现在小鼠心肌细胞闰盘处存在一种CaMKⅡ/βⅣ-spectrin/ankyrin-G/Nav1.5复合体，该研究认为此复合体对心脏兴奋性调控至关重要。

（十三）其他蛋白

PTPH1是蛋白酪氨酸磷酸酶，在多种组织包括心脏广泛表达。研究者首先利用酵母双杂交实验筛选发现PTPH1可与Nav1.5通道蛋白结合，进一步通过牵出实验证实其与Nav1.5的结合部位位于通道蛋白C末端PDZ结合域。PTPH1与Nav1.5的共表达可致通道稳态失活曲线负移，而对于缺失C端PDZ结构域的Nav1.5通道，这种依赖于PTPH1的通道生物学特性的调节作用则消失。

成纤维细胞生长因子同源因子（FHF）家族成员FGF12与FGF14均可与Nav1.5通道蛋白C末端区域结合，并已在不同表达系统中证实两者可调节通道门控动力学。近来发现，FGF13是在小鼠心脏组织FHFs中的主要亚型，有研究者通过免疫共沉淀和牵出实验发现FGF13同样结合于Nav1.5通道蛋白的C末端。小鼠心室肌细胞的免疫组化显示FGF13与Nav1.5共定位于细胞侧膜和闰盘处。进一步通过FHF13沉默的方法揭示了FGF13可调节小鼠心室肌细胞Nav1.5通道的功能和其在膜上的表达，进而改变心脏传导特性。

14-3-3η是一种二聚体胞质衔接蛋白，Allouis等研究者证明它可以与Nav1.5的DⅠ-Ⅱ连接环结合。通过对成年兔的心肌细胞进行免疫组化实验，研究者发现Nav1.5与14-3-3η共定位于细胞闰盘处。此外，14-3-3η与Nav1.5在COS细胞共表达，可调节Nav1.5通道的电生理特性。

α-actinin-2属于F-actin交联蛋白家族，与Nav1.5的DⅢ-Ⅳ连接环相结合。免疫组化显示α-actinin-2与Nav1.5在Z线和胞质膜均有共定位现象。免疫共沉淀和牵出实验也证实了spectrin样重复序列在α-actinin-2和Nav1.5的相互作用中具有关键作用。在功能方面，两者的相互作用可增加钠电流密度，但不改变通道的门控动力学特性。

ZASP在维持心肌以及骨骼肌Z盘稳定性方面具有重要作用。其突变D117N曾被报道与扩张型心肌病（DCM）和左室心肌致密化不全的发病相关。当该突变与Nav1.5共表达于HEK293细胞或乳鼠心肌细胞时，可导致钠电流降低约30%，同时稳态激活及失活曲线均正移，失活后恢复减慢。另一DCM相关ZASP突变S196L曾于一个DCM家系中被发现，Li Z等研究者发现携带该突变的小鼠模型中钠电流及L型钙电流均发生改变。另外，牵出实验证实ZASP与Nav1.5和Cav1.2共同构成了一个复合体，然而该复合体之间的相互作用是直接作用还是间接作用仍不明确。他们还发现无论是野生型还是突变型ZASP都与Nav1.5和Cav1.2在心肌细胞的Z线处具有共定位现象。

Ishikawa等对190名BrS患者进行基因检测发现肌质网膜相关蛋白SLMAP基因的两个错义突变（V269I和E710A）与BrS发生有关，且SLMAP突变可使细胞膜上Nav1.5通道表达下调，同时并不改变通道门控特性，提示SLMAP突变影响Nav1.5通道蛋白迁移。然而免疫共沉淀方法并未检测出SLMAP与Nav1.5通道蛋白的直接结合作用，提示SLMAP可能不是VGSC的直接构成成分，但其对Nav1.5通道迁移的调节作用已得到认可，另外其作为BrS相关基因在临床疾病筛查方面的潜在作用值得关注。

四、总结与展望

过去几年中，有关SCN5A的基因突变以及相应Nav1.5通道功能改变的研究已经取得了重要成果及进展。基于近年来报道的多种直接或间接与Nav1.5相互作用的蛋白，我们有理由推测，对于Nav1.5通道的生物合成以及功能等方面的调节远比预期复杂。目前究竟有多少种Nav1.5互作蛋白以及它们以何种方式共同形成大分子复合物仍不清楚。未来对于新的Nav1.5互作蛋白的探索以及各种互作蛋白间的复杂作用将会有助于阐明心律失常的分子机制。

（李泱 陈曦）

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