5　线粒体的离子通道

线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞氧化磷酸化、电子传递和产生能量的重要场所，心肌线粒体为不断运动的心脏提供能源。多种因素可以导致线粒体功能障碍，进而引起心血管疾病的发生发展。线粒体结构由外至内可分为线粒体外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）、线粒体膜间隙、线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM）和线粒体基质四个功能区。近年研究发现，其外膜和内膜上存在离子通道或离子转运体，不仅参与线粒体和细胞内的离子调节，而且调控着线粒体结构和功能，进而影响心肌细胞的生理过程，与心血管疾病的发生发展密切相关。本章将介绍线粒体离子通道与心血管疾病的关系，这对于阐明心血管疾病的发病机制、药物研发具有重要意义。

一、电压依赖性的阴离子通道

电压依赖性的阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）位于线粒体外膜，由30kD单个多肽构成β-桶样结构的通道蛋白，含19个跨膜的反向平行β-链折叠和氨基酸残基形成α-螺旋，其N端黏附在孔的内壁上，具有一定的自由度。N端是个关键的功能区域，可与诸多蛋白发生相互作用。VDAC在细胞线粒体上广泛分布，人类VDAC具有三种亚型（VDAC1、VDAC2和VDAC3），分别由三个不同基因编码。不同亚型的VDAC，表现出不同的生理功能，其中以VDAC1在心肌细胞上分布最多。

既往认为，线粒体外膜的VDAC与位于内膜的腺嘌呤核苷酸转运蛋白（ANT）和位于基质的环孢素受体D（CyP-D）共同组成线粒体渗透性转换孔（mPTP）。但新近研究发现，VDAC可能不是mPTP的组分，而是线粒体外膜上独立存在、与多种蛋白形成微结构域的重要通道蛋白，例如在肌质网释放钙离子时，它可以与线粒体内膜的钙离子单向转运孔及肌质网上葡萄糖调节蛋白75（GRP75）和早幼粒细胞白血病蛋白（PML）形成临时结构域，使得钙离子迅速转运到线粒体内（图1-5-1）。

VDAC具有电压依赖性和离子选择性。低电压（线粒体膜<20mV）时，通道处于稳定开放状态，此时阴离子可以非选择性地自由通过；高正电压（线粒体膜>20mV）时，VDAC呈阳离子选择性，主要通过Ca2+。该通道也可通过一些小分子物质，如水、代谢物、NADH、ADP和ATP等。研究发现只要其形成合适地折叠方式，VDAC也可传递DNA序列和tRNA。因此VDAC是线粒体与细胞质之间进行各种代谢物质流通的重要通道，也是维持线粒体与胞质之间进行能量代谢的重要途径。

VDAC通过与促凋亡（Bax/Bid）或抑凋亡（Bcl-xL）蛋白相互作用，参与细胞的凋亡调节。抗凋亡蛋白Bcl-xL可关闭VDAC，抑制细胞的凋亡，心肌缺血再灌注损伤中起保护心肌的作用，而促凋亡蛋白（Bax/Bid）则能促进VDAC开放，引起细胞色素c（Cyt c）的释放和线粒体膜电位（ΔΨm）下降，诱导心肌细胞的凋亡。线粒体来源的氧自由基可通过VDAC释放入细胞质，导致线粒体膜脂质过氧化损伤，通透性增高，引起细胞损伤。VDAC不仅与氧自由基转运有关，同时也影响氧自由基生成。过表达VDAC1可增加细胞内氧自由基生成。相反，沉默VDAC1后则可下调百枯草诱导的氧自由基生成。

VDAC除了维持线粒体及细胞的能量和物质代谢平衡，还能够调节细胞线粒体钙循环，参与心血管疾病的发生与发展。VDAC上存在Ca2+结合序列，Ca2+与VDAC结合可调节VDAC活性。过表达VDAC可使少量从内质网释放的Ca2+，快速扩散到线粒体内，增加线粒体中Ca2+浓度。研究发现线粒体DNAA4263G突变携带者细胞线粒体VDAC的表达上调，线粒体内Ca2+浓度增加，而VDAC抑制剂CsA可以逆转，认为VDAC表达和功能的改变介导了线粒体钙循环紊乱、线粒体功能障碍，引起患者血压升高，提示VDAC可能在高血压的发展中起重要作用。

心肌肥厚患者心肌组织的VDAC1 mRNA显著上调。研究认为，VDAC1参与NHE-1抑制剂的抗心肌肥厚作用。运动对心肌梗死后心肌重构的改善作用，伴随VDAC2下调和谷胱甘肽过氧化物酶上调。因此，VDAC可能与心肌梗死、心肌肥厚等心肌病的发生发展相关。

二、线粒体ATP敏感性钾通道

1991年Inoue等首次在大鼠的肝细胞线粒体内膜上证实了线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）的存在，其主要功能是作为K+运输体，将K+转运至线粒体基质内。近年研究显示，mitoKATP在急性心肌缺血、心肌梗死、心律失常、高血压等疾病的发生发展过程中起着重要作用。此通道在正常情况下处于关闭状态，但在组织缺血、缺氧或能量耗竭时被大量激活，使细胞快速去极化，扩张血管增加供血、减少氧耗，进而发挥保护心肌的功能。故mitoKATP通道已成为缺血性心脏病的一个重要治疗靶点。

mitoKATP位于线粒体内膜上，是由内向整流钾通道（Kir）和ATP结合蛋白（ATP-binding cassette，ABC）两部分组成的异源八聚体，前者形成离子通道，后者决定KATP的功能。研究表明，mitoKATP除了若干亚基不同，大体结构与细胞膜上KATP（sarcKATP）相似，不同亚型的相互偶联导致了不同组织器官的KATP特性和功能的复杂性。mitoKATP通道的分子结构尚未完全阐明，目前认为，参与组成mitoKATP的亚基主要为Kir6.1和Kir6.2。组成KATP通道的ATP结合蛋白包括磺酰脲受体（SUR），SUR包括3个亚基，分别为SUR1、SUR2A和SUR2B。最新研究发现ROMK2（Kir1.1b）是心脏mitoKATP通道形成的主要亚基，且对经典的mitoKATP调节因子［二氮嗪和5-羟基癸酸盐（5-HD）］有反应。而作为调节亚基的SUR2被确定为与二氮嗪敏感性有关，ROMK2是否与SUR2共同形成功能性钾通道迄今尚未明确。

KATP敏感性通道不同于其他类型的钾通道电生理学特性，是由细胞内ATP和ADP共同调节的一类选择性的非电压依赖性钾离子通道，受电压和细胞内ATP浓度的双重调节，生理状态下该通道处于关闭状态。mitoKATP通道的开放主要受细胞内ATP与ADP浓度比值的影响。只有当Mg2+存在时，ATP对通道才发挥抑制作用。鸟苷酸可扭转ATP对通道的抑制效应。很多代谢因素和药物的调控也会影响到mitoKATP的开放和关闭。二氮嗪（diazoxide）是mitoKATP通道特异性开放剂，5-HD则是该通道阻滞剂。

mitoKATP主要产生两方面的生物学作用：一是调节线粒体内K+浓度，以维持线粒体容积的稳定，促使线粒体能量代谢相关酶的表达，对细胞具有保护作用；另一方面参与线粒体的氧化与磷酸化过程，经此通道摄取K+可部分弥补因质子泵转运H+引起的电荷变化，从而维持线粒体跨膜电位的稳定性。当组织缺血或缺氧时，ATP/ADP的比值降低导致mitoKATP开放，mitoKATP开放后的作用是双向的，在缺血早期，mitoKATP开放，可减少ROS的生成，产生保护效应；而在再灌注期，mitoKATP开放，抑制ROS的大量生成，减轻再灌注损伤。mitoKATP开放可使线粒体内膜电位下降，抑制了Ca2+内流，缓解线粒体内钙超载，阻止或延缓心肌的损伤。线粒体通透性转换孔（mPTP）作为细胞凋亡的触发点，其开放时可诱导细胞凋亡因子，触发凋亡。而mitoKATP和mPTP之间有密切的关系，mitoKATP的开放可抑制mPTP的开放而稳定膜电位，从而达到保护心肌的作用。mitoKATP开放时，K+进入线粒体导致基质肿胀使肌酸激酶和腺嘌呤核苷酸移位酶在线粒体外膜的功能性偶联更强，该偶联使线粒体磷酸化肌酸而非ADP，而被磷酸化的肌酸有利于能量转移到细胞质，通过减少线粒体ATP的消耗来减轻细胞能量代谢以降低细胞的凋亡或者坏死。mitoKATP参与预处理和后处理的心肌保护。缺血预处理时，线粒体内膜KATP通道开放促进K+内流，降低了内膜电位差，减小Ca2+内流动力，线粒体基质容积增加，激活电子传递链，促进线粒体呼吸，ATP合成增加，同时促使部分Ca2+从线粒体进入胞质，减轻线粒体Ca2+超载，保护了细胞。

三、线粒体钙离子单向转运体

线粒体单向转运体复合物被认为是参与线粒体内膜Ca2+摄取的一组蛋白，而线粒体钙单向转运蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是该复合物中的关键通道蛋白，可顺电化学梯度摄入Ca2+。参与复合物组成的还有负性孔隙形成亚基（MCUb）、线粒体钙摄入蛋白1（MICU1）、线粒体钙摄入蛋白2（MICU2）、线粒体钙单向转运体调节蛋白1（MCUR1）和必要的线粒体钙单向转运体调节蛋白（EMRE）（图1-5-2）。

作为线粒体内膜上的特异性Ca2+通道，MCU复合物的主要特性是对Ca2+具有高选择性，低亲和力，生理条件下平衡解离常数（KD）仅为20～30mol/L。胞质钙离子浓度在5～10mol/L之间可以形成相当大的线粒体钙离子内流，但在健康的活细胞中从没有观察到胞质具有如此高的钙离子浓度。然而有研究表明，线粒体与肌质网膜在结构上邻近，在线粒体和内质网钙离子通道间的紧密位置能形成瞬间高浓度钙离子的微区，确保了MCU复合物对胞质钙离子吸收所需要的高钙离子浓度，进而将Ca2+转运至线粒体内。

MCU的主要功能是将胞质Ca2+转运至线粒体基质，并控制转运速率，其在细胞内Ca2+信号转导、Ca2+稳态、线粒体能量代谢和细胞凋亡方面具有重要意义。Ca2+通过MCU进入线粒体，激活线粒体内脱氢酶和ATP合成酶，调节线粒体的氧化磷酸化。MCU磷酸化后能加快细胞Ca2+摄取和ATP生成，维持细胞功能；但随着MCU磷酸化水平的升高，可导致线粒体Ca2+超载，线粒体内ROS过量生成，诱导细胞凋亡。

生理状况下，MCU并非单独行使功能，而是与MICU1、MICU2、MCUR1和MICUb等调节蛋白相互作用，调控线粒体在不同条件下Ca2+所需的浓度，保证细胞生理功能的正常运转，防止病理情况下由于Ca2+超载、ROS生成过多而引起的氧化应激以及细胞损伤等。

MICU1位于IMM的外表面，是一个54kD的单跨膜蛋白，含有两个高度保守的EF-臂Ca2+结合结构域。MICU1通过与MCU结合从而相互作用，其EF-臂结构域调节MCU活性。因此，MICU1调节MCU介导的线粒体Ca2+吸收作用。当胞质Ca2+浓度较低时，MICU1维持MCU正常状态，限制少量的Ca2+流入线粒体，发挥保护作用；随着Ca2+浓度升高，MCU磷酸化水平的升高，EF手形结构域协同开放MCU通道，加快细胞Ca2+摄取。

MICU2在线粒体膜间隙和MICU1形成二聚体，对MCU具有不同的调控作用。MICU1介导胞内Ca2+信号，调节线粒体氧化磷酸化；MICU2则抑制线粒体对Ca2+的摄取。在MICU2过表达的HeLa细胞中，线粒体对Ca2+的摄取显著减少。研究表明MICU1、MICU2和MCU均位于同一复合物中，它们之间相互协同，如：①在小鼠肝脏细胞中，用siRNAs沉默MICU1和MICU 2可导致MCU蛋白表达降低，并且MCU复合物的大小发生转变；②在HEK293细胞中，MICU1敲除可导致MICU2水平的降低。此外，MCU的过表达可增加MICU1和MICU2表达；③在HeLa细胞中，MICU1下调导致MICU2蛋白水平降低，反之亦然。

MCUb是MCU的同源体，与MCU具有50%的相似性，但其表达水平较MCU低。MCU与MCUb相互作用，在完整细胞中，MCUb的过表达可减少线粒体Ca2+摄取。MCUb表现为一种内源性负性显性特征。在复合物中，插入一个或多个MCUb亚基，将延缓线粒体对Ca2+的摄取。

MCUR1位于IMM上，对线粒体Ca2+摄取和基质内Ca2+稳态中有起着重要作用。有实验研究表明，MCUR1与MCU相互作用，但不与MICU1相互作用。MCUR1直接参与MCU介导Ca2+摄取的调控，随着MCUR1活性增加，线粒体Ca2+摄取增多。敲除MCUR1引起线粒体Ca2+浓度下降。过表达MCUR1时，MCU活性增强，线粒体Ca2+摄取增多。

EMRE是MCU与MICU1、MICU2之间的Ca2+结合的蛋白，介导MCU与MICU1、MICU2的相互作用。敲除EMRE后，MCU活性降低，线粒体Ca2+摄取减少；而敲除MCU则引起EMRE表达降低。

研究显示，MCU在生理性心率加速中的作用必不可少。随着MCU氧化磷酸化增多，迅速加快起搏细胞内线粒体Ca2+摄取速率，确保胞内Ca2+既达到需求又不会引起超载。在心肌细胞内，1-肾上腺素能受体信号通路可促使PYK2依赖的MCU磷酸化，加速MCU开放和Ca2+摄取，导致线粒体Ca2+超载并启动凋亡信号。有研究发现，心肌在缺血再灌注损伤时，MCU介导的线粒体Ca2+摄取能够激活mPTP，促使细胞凋亡，加速心肌细胞损伤。

四、线粒体钠钙交换电流

在心肌细胞中，线粒体的钙离子外排主要由钠钙交换体（NCLX）完成。1974年，Carafoli等首次在心肌细胞的线粒体中发现有Na+溶度依赖性的Ca2+外排，NCLX位于线粒体嵴上，仅对Na+和Ca2+通透，当细胞内Na+浓度增加时，线粒体的钙离子外排增加，而K+、Rb+和Mg2+均不引起线粒体的钙外排。最初Cai等认为线粒体钠钙交换体属SLC24基因家族编码的钾依赖的钠钙交换蛋白，K+参与Na+-Ca2+的交换，但随后Palty等发现提高胞内Li+可促进线粒体钙外排，抑制NCLX表达后，此现象不明显，但未发现K+参与NCLX蛋白对线粒体钙的转运，因此也将线粒体的钠钙交换体称为钠钙交换体（NCLX），而对锂的通透性也是线粒体钠钙交换体特有的属性。

NCLX诱导的线粒体钙释放可被其阻断剂CGP-37157所抑制。当过表达NCLX时，线粒体Na+浓度的增加可诱导钙外排，而下调NCLX时，线粒体钙外排减少。与传统NCX蛋白相比，NCLX蛋白第五跨膜和第六跨膜间的胞内环非常短，这就意味着NCLX蛋白可能无钙离子结合区域。目前对NCLX的功能及离子转运机制的了解仍非常有限。NCLX转运离子是电中性的（2Na+/Ca2+）还是生电性的（3～4Na+/Ca2+）仍存在争议。若为生电性的，在应激或疾病状态下，当线粒体的膜电势发生变化时，NCLX可以被激活，从而改变细胞内Ca2+浓度及钙离子敏感蛋白质的活性。

心肌细胞NCLX通过对线粒体钙离子的调控，影响肌质网钙离子的释放，从而参与调节心肌细胞的自主节律。NCLX的敲低引起由线粒体释放到细胞内的钙减少，导致肌质网的钙释放和钙摄取降低，引起钙瞬变的延迟和自发动作电位周期的延长。心力衰竭时，线粒体钙代谢起着重要作用，此时伴随细胞内Na+内流，可通过线粒体NCLX钙离子转运，减少线粒体内钙浓度，降低线粒体的氧化磷酸化和ATP的产生，导致心肌细胞抗氧化能力降低。因此在豚鼠的心力衰竭模型中发现，用CGP-37157阻断NCXL的活性具有心肌保护作用。

五、线粒体通透性转换孔道

线粒体通透性转换孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是位于线粒体内膜上，具有非选择性、高导电性的复合通道。该孔道不可逆的开放，将造成线粒体膜电位的丧失，激活线粒体凋亡通路，导致细胞死亡。

mPTP的结构仍不完全清晰，早期认为mPTP主要由线粒体外膜的VDAC、内膜腺苷酸转移酶（ANT）、基质亲环蛋白D（CyP-D）和其他蛋白等组成。最新发现，剔除VDAC并不影响mPTP的功能，Ca2+和氧化应激能同等程度地诱导VDAC剔除型线粒体和普通线粒体的mPTP开放。因此认为，VDAC可能不是mPTP发挥功能的必需组分。ANT位于线粒体内膜，是一种线粒体载体家族中的跨膜蛋白，控制ATP与ADP转换，将ATP转运到细胞质中。ANT只转运自然形式的ATP和ADP，具有高度特异性。当ATP、ADP与胞质侧ANT的ATP/ADP位点结合时，激活mPTP孔道；当其与膜内侧的ANT位点结合时，则使mPTP关闭。CyP-D位于线粒体基质内，参与蛋白的折叠和运输。CyP-D上具有Ca2+及ANT结合位点，Ca2+超载和ATP消耗时，CyP-D先后与Ca2+及ANT结合，使ANT构象发生改变，从而促进mPTP开放。与正常小鼠相比，CyP-D敲除小鼠可抑制由Ca2+超载或氧化应激引起的mPTP开放及细胞死亡，且CyP-D敲除鼠的心肌对缺血再灌注损伤的耐受性较野生型明显增强，说明CyP-D是mPTP的一个重要调节元件，调节着mPTP对钙离子的敏感性。最新发现ATP合酶的F1和F0亚基参与mPTP的组成，尤其是在纯化的线粒体脂质双分子层中ATP合酶F0的c亚基可形成电压敏感性、持续开放的孔道，导致线粒体内膜的快速且不受控制的开放。耗竭c亚基可减弱Ca2+引起线粒体内膜的去极化，抑制Ca2+及活性氧诱导的细胞死亡，而增加的c亚基的表达容易导致细胞死亡。

生理状态下，mPTP处于关闭状态，线粒体内膜仅对某些代谢底物和离子有选择性通透（<1.5kD）。影响mPTP开放的因素很多，其促进孔道开放的因素主要有：胞质和线粒体基质内Ca2+增加、活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄积、氧化应激、ΔΨm下降、能量衰竭、pH升高、无机磷酸盐及游离脂肪酸增加、促凋亡Bax表达增加等。

再灌注初期，Ca2+超载和ROS的大量产生均是造成mPTP不可逆开放的重要原因。mPTP的开放一方面引起线粒体内膜通透性增加，使胞质中的大量正离子进入线粒体，降低ΔΨm，导致部分ATP被用来恢复质子梯度，加重细胞耗能。另一方面降低ATP合成的驱动力，减少ATP合成，引起能量代谢障碍。同时，由于Ca2+在线粒体内不断积聚，加重线粒体钙超载，引起线粒体损伤甚至细胞坏死或凋亡。另外，mPTP开放可导致线粒体基质膨胀引发外膜破裂，促使大量凋亡蛋白的释放，促使细胞坏死。轻度缺血或再灌注最初几分钟，可通过激活mitoKATP的开放而抑制mPTP的开放，稳定膜电位，从而达到保护心肌的作用。

六、展望

综上，线粒体的离子通道或离子转运体在调节线粒体生理功能的同时也影响着心肌细胞的生理过程，而一些通道的开放和关闭在心肌细胞的保护和损伤中起着关键的作用，进而影响心血管疾病的发生发展。因此，进一步揭示离子通道或离子转运体的分子结构，探讨系统的线粒体离子通道与心血管疾病的关系，无疑为揭示心血管疾病的发生机制开辟了一个新的途径，也将为线粒体离子通道的新药研发提供思路，从线粒体中找到治疗心血管疾病的药物也是目前最有前景的研究方向之一。

（谢晓婷 徐斌 李泱）

参考文献

［1］Palty R，Silverman WF，Hershfinkel M，et al.NCLX is an essential component of mitochondrial Na+/Ca2+exchange.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（1）：436-441.

［2］Finkel T，Menazza S，Holmstrom KM，et al.The ins and outs of mitochondrial calcium.Circ Res，2015，116（11）：1810-1819.

［3］Sekler I.Standing of giants shoulders the story of the mitochondrial Na（+）Ca（2+）exchanger.Biochem Biophys Res Commun，2015，460（1）：50-52.

［4］Martel C，Wang Z，Brenner C.VDAC phosphorylation，a lipid sensor influencing the cell fate.Mitochondrion，2014，19 Pt A：69-77.

［5］Kamer KJ，Mootha VK.MICU1 and MICU2 play nonredundant roles in the regulation of the mitochondrial calcium uniporter.EMBO Rep，2014，15（3）：299-307.

［6］Patron M，Checchetto V，Raffaello A，et al.MICU1 and MICU2 finely tune the mitochondrial Ca2+uniporter by exerting opposite effects on MCU activity.Mol Cell，2014，53（5）：726-737.

［7］Carraro M，Giorgio V，Sileikyte J，et al.Channel formation by yeast F-ATP synthase and the role of dimerization in the mitochondrial permeability transition.J Biol Chem，2014，289（23）：15980-15985.

［8］Henn MC，Janjua MB，Kanter EM，et al.Adenosine Triphosphate-Sensitive Potassium Channel Kir Subunits Implicated in Cardioprotection by Diazoxide.J Am Heart Assoc，2015，4（8）：e002016.

［9］Noskov SY，Rostovtseva TK，Chamberlin AC，et al.Current state of theoretical and experimental studies of the voltage-dependent anion channel（VDAC）.Biochim Biophys Acta，2016，1858（7 Pt B）：1778-1790.

［10］Williams GS，Boyman L，Chikando AC，et al.Mitochondrial calcium uptake.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（26）：10479-10486.