第六节　循环肿瘤干细胞与肝癌门静脉癌栓

循环肿瘤细胞 （CTCs）除了包括自发自肿瘤原发灶或者转移病灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞外，还包括在诊疗操作中造成的肿瘤细胞脱落而进入血液循环系统的肿瘤细胞。140多年前，澳大利亚学者Ashworth在一例因癌症死亡的患者外周血中通过显微镜偶然发现了类似肿瘤细胞的细胞，率先提出了CTC的概念。近些年的研究也证实了，肝癌细胞的确会释放进入血液循环系统，并且这些细胞可作为癌症的生物标志物，可用于“液态活检”。由于其来源的特殊性，在肿瘤患者外周血中检测到的CTCs可能从某种程度上反映患者体内肿瘤细胞的遗传状况和药物敏感性，从而为临床监测肿瘤的复发转移、判定肿瘤患者的预后提供依据，为实现肝癌的早期诊断和肝癌患者的个性化治疗带来了另一种思路。

一、外周血CTCs的分离和检测方法

理想的分离检测CTCs的平台具有以下几个特征：①能检测能够检测到每一个癌症患者样品血中的每个CTCs，同时在健康对照的样品中没有假阳性的出现；②高纯度，分离的CTCs不能混杂其他正常细胞；③能够保持分离得到的CTCs的活性、形态正常、蛋白核酸稳定，以便开展后续的实验研究和临床特性的获得；④廉价、高产出、快捷，以便临床推广；⑤结果稳定，可重复。

到目前为止，相比于乳腺癌和结肠癌，仅有少数学者对中CTCs 的检测和定量方法进行了研究。肝癌中循环肿瘤细胞数目少，在外周血中，大约每10⁶～10⁷个单核细胞中才有一个循环肿瘤细胞，并且由于肝癌本身更高的异质性和由于上皮-内皮转化（EMT现象）而缺少特异性的细胞表面抗原，使肝癌中的CTCs检测难度加大。相比于乳腺癌和结肠癌，目前仅有较少数的对肝癌中CTCs的检测和定量研究（表2-9）。表2-9简述了过去十年间，肝癌领域中对于CTC的研究进展。这些研究采取的研究材料各异：有些直接采用患者的血样，有的应用细胞系或小鼠的动物模型；同时，受限于工艺差别以及各自不同的研究背景，这些报道所采用的CTC富集和检测的方法不一样，得到的结果也各有差异。一般说来，CTC检测的方法包括富集和检测两个步骤。

在肝癌患者的外周血单核细胞中，存在肝细胞特异性基因或者肿瘤细胞相关基因的表达，包括AFP、端粒酶反转录蛋白（TERT）和转录因子Snail等，能来检测肝癌患者外周血中的CTCs。Waguri等报道了hTERT mRNA的表达可以在肝癌患者中，作为一个特异性的CTCs检测工具。他们应用该方法在55例肝癌患者中有29例患者检出CTCs（53%的检出率）。但是该方法具有容易破坏CTCs细胞不能进行后续鉴定和应用的局限性，同时，在肝癌中尚缺乏一个高特异性的标记物。

ISET法是利用滤过孔径为8μm大小的聚碳酸酯膜分离外周血CTCs，由于相对于外周血中其他的单核细胞，CTCs细胞较大（＞8μm），因此外周血裂解红细胞后的单核细胞滤过膜时，直径较大的CTCs会留在膜上，再通过特殊的洗脱液洗脱，就会得到CTCs。与该原理相似，随后又开发了便携式微型滤过器、三维微型滤过器等也应用于肝癌的CTCs的检测。该方法不仅可以进行计数，还可以保持检测到的CTCs活性，以进行随后的细胞抗原以及细胞特性的鉴定试验。但是，该方法所获取的细胞假阳性率高，并且丢失了小体积的CTCs，而这类细胞可能具有更高的侵袭性。

流式细胞技术是基于细胞表面特殊标记，来确定细胞种类和检测肝癌外周血CTCs，常用的肝癌外周血CTCs的标记有上皮细胞黏附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EPCAM），甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），细胞角质蛋白（creatine kinase，CK）以及CD90等。Yang等应用流式细胞技术检测肝癌患者外周血中CD45-CD90+的细胞分布，在34例肝癌患者中检测率为90%，而在正常人和肝硬化患者中没有检测到。应用流式细胞技术检测外周血CTCs，操作比较简单，细胞丢失率小，并且应用现有的高规格的流式检测分离平台所得到的细胞也可以进行后续细胞特性的验证。但是由于缺少特异性高的细胞表面标记，易造成检测到的细胞假阳性率高。

CellSearch循环肿瘤细胞检测是自动化捕获计数循环肿瘤细胞的检测技术，是第一个也是唯一一个在美国、欧洲和中国均获得临床验证并批准的循环肿瘤细胞检测系统，用于全血中的上皮源性（CD45-、EpCAM+以及细胞角质蛋白8、18+和/或19+）的循环肿瘤细胞（CTC）的计数检测。本检测是对转移性乳腺癌患者进行监测的一项工具，可实时评价患者的预后，对患者的无进展生存期与总生存期进行预测。在肝癌中，Schulze等采用该技术，在59例肝癌患者中18例检测到CTCs，并且发现其检出阳性率与肝癌的巴塞罗那分期（BCLC分期）相关，可用于指导BCLC分期。该检测方法虽然由多项大样本多中心临床研究进行支持，但是由于肝癌在上皮-间质转化（EMT）转化过程中，大量的CTCs会丢失EpCAM表面抗原，这使得基于该方法所检测到的肝癌外周血CTCs，只是外周血CTCs总数的一小部分（图2-12）。

二、应用Image Flow Sight检测外周血液循环肿瘤细胞

目前，尽管检测肝癌外周血CTCs的方法众多，但并没有一种完美的方法可以解决问题。我们课题组基于近几年的对于肝癌CTCs的研究，建立了一种新型的肝癌CTCs的检测方法。该方法基于Image Flow Sight检测外周血中高核质比的细胞。

Flow Sight即液相成像流式，是一种成像流式系统，可以对检测的细胞进行实时成像，依据细胞形态学来进一步确定阳性细胞，从而提高了检测的准确性。我们应用其对检测目标成像以及能对特定区域进行量化计算的特点构建了一个特殊的参数，即核质比（图2-13）。众所周知，肿瘤细胞由于其特殊的代谢特征，具有相对于正常细胞有更高核质比的特性，正是依据肿瘤细胞的这一特点我们构建了这一模型。而随后的实验也验证了我们的这一猜想。我们发现在肝癌患者的外周血中的确存在一群具有高核质比的细胞群（High Karyoplasmic Ratio Cells，HKR cells）功能分析可知该细胞群确实具有分裂增殖的特性，因此我们就定义这一群细胞为肝癌患者的CTCs。

根据以上原理，我们随后建模，预测HKR细胞的数目与肝癌特性以及肝癌患者的临床预后的相关性。结果证实，利用该技术检测到的循环肿瘤细胞数目（HKR cells）可以用于肿瘤的诊断（21.8；AUC=1.000），以及肝癌患者MVI的术前预测（57.3；AUC=0.824）。随后的近一年随访中，HKR细胞的数目与肝癌患者的复发率显著相关，HKR细胞数目较多的患者的复发率明显高于HKR细胞少的患者（22/45例 vs 3/12例）。

综上所述，我们利用image flow sight技术，建立了一项基于核质比的循环肿瘤细胞检测技术，并且以该技术的检测到的HKR细胞数目与肝癌特性和肝癌患者的临床预后相关。我们的对比试验也证明，运用该技术所得到的结果要优于传统的基于EpCAM等细胞表面标记流式。Image flow sight 设定模块及其运算，实时成像更准确，该方法不涉及抗体标记，选用的高核质比为所有肿瘤细胞的共性，检测的细胞群体更大。

三、展望

随着肝癌中CTCs检测技术的不断发展，CTCs对于肝癌诊断、治疗的意义也不断被证实。CTCs“液态活检”在肝癌的早期诊断中具有重要价值，且CTCs计数与肝癌多灶性、门静脉癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分级密切相关。外周血CTCs数与肝癌患者的预后密切相关，CTCs计数越多，患者预后越差。治疗前后外周血CTCs数量变化可评价肝癌的治疗效果。尽管目前CTCs的临床应用尚未普及，随材料学和组织学的发展、CTCs分离技术不断提高，CTCs在肝癌诊断、预后及疗效评价中具有广阔应用前景。

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