第四节　肝癌门静脉癌栓的代谢组学研究

代谢组学是继承基因组学和蛋白质组学的研究思想的一门新兴学科，其优势在于生物体内基因组和蛋白组的变化均可反映在其代谢物上的变化，并且可对小分子代谢产物进行定量分析，故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。近年来也成为肿瘤研究的热点。

早在20世纪20年代，Warburg先生发现肿瘤在有氧环境下进行无氧糖酵解。这种快速消耗而低效产能方式称之为瓦尔伯格效应。随着对肿瘤研究的不断深入，发现肿瘤可通过代谢重构的方式快速摄取、消耗为增殖或转移提供能量及合成原料。代谢重构是由基因、蛋白质及微环境等因素共同参与形成的复杂而立体关系网络，影响相关代谢酶活性及代谢产物的生成，最终赋予细胞不同的表型。

一、肝癌的代谢组学研究进展

肝癌因其发病率及死亡率高而闻名，肝癌的恶性表型（如增殖、转移、耐药、抗凋亡等）与代谢重构所提供的能量、合成原料等密不可分。因此，近年来很多学者或团队从肝癌的异常代谢入手研究肝癌的发生、发展，并为治疗提供有力的证据及参考。

Irene等研究发现，丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase isoenzyme type M2，PKM2）是糖酵解途径中的关键酶，肝细胞癌中过表达可预示临床病理特征和预后不良。PKM2可被miR-122抑制，抑制PKM2表达可有效抑制有氧糖酵解，进而降低肝细胞癌的增殖、转移能力。Chris等发现，作为Bcl-2蛋白家族中的成员之一，Bim siRNA可显著的抑制PKM2消耗诱导的凋亡，同时PKM2的消耗可降低Bim的分解，PKM2与Bim的表达水平相结合可更好的提示预后。

Salvatore等发现，抗凋亡蛋白聚合酶［anti-apoptotic protein poly（ADP-ribose）polymerase 14，PARP14］通过抑制前凋亡激酶JNK1，导致Thr365磷酸化激活PKM2促进有氧糖酵解。PARP14的高表达不仅与肝癌预后较差有关，还可以提高抗肝癌药物的敏感性。Mimori 等研究发现，果糖1-6二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，FBP1）是糖异生中重要的限速酶。低表达FBP1的肝癌具有恶性程度更高，预后更差，肿瘤更易复发等临床特点，过表达后可抑制肿瘤增殖及降低肝癌细胞内有氧糖酵解的葡萄糖摄取。FBP1不仅可以作为表示预后的标志物，也为治疗提供新靶点。肝癌代谢途径中的关键酶可受多个上游调控，最终表现在关键酶变化导致的代谢重构上，因此，逆转代谢通路上关键酶所致的代谢重构，有望成为治疗肝癌的关键。

Tong等通过分析大量肝癌与癌旁组织的基因芯片，筛选有关碳源代谢并且在肝癌组织中RNA水平显著升高的差异性表达基因有22种。其中16种是糖酵解途径中重要的关键酶，如柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）和乙酰辅酶A合成酶短链家族1（acetyl-CoA synthetase short-chain family member 1，ACSS1），它们是改变乙酰辅酶A转换和三羧酸循环的关键酶。肝癌中CS与ACSS1的高表达促进了代谢重构，为肿瘤增殖提供能量与基础物质。通过干扰CS与ACSS1的表达，可显著降低肿瘤恶性表型。进一步研究发现，373例肝癌中这22种基因有参与（最少1种）高表达的患者与没有这22种基因改变的患者相对比，中位生存期分别是30.58个月 vs. 80.68个月；Log-Rank Test P=2.71×10⁻⁴）。

Huafeng等发现，当肿瘤缺乏葡萄糖和谷氨酰胺两种营养来源时，cMyc可转录上调多种丝氨酸合成途径（serine biosynthesis pathway，SSP）酶从而激活SSP，同时促进谷胱甘肽（glutathione，GSH）生成，以在营养缺乏条件下维持肝癌细胞的周期进展与核苷酸合成，保障其生存及增殖能力。磷酸丝氨酸磷酸酶（phosphoserine phosphatase，PSPH）是SSP中最后的限速酶，不仅与cMyc驱使的癌症进展密切相关，更重要的是与（肝癌）患者的死亡率呈高度相关。

Chen等也有研究发现，CD147可促进细胞表面MCT1的表达和乳酸的外排，导致PI3K/Akt/MDM2 激活及提高P53的降解。CD147促进糖酵解的同时，也可被P53所上调的GLUT1和PFKL的激活抑制线粒体的生物合成及功能所调停；也可被P53依赖性下调的PGC1α、TFAM及p53R2所调停。

Xing等发现，CD147不仅可以影响肝癌糖酵解代谢，还可以导致脂肪酸代谢重构。一方面CD147通过Akt/mTOR信号通路上调固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP1c）的表达，使脂质基因FASN、ACC1转录激活，促进脂质合成；另一方面，CD147通过激活p38 MAPK信号通路抑制过氧化物酶体增殖物活化受体α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）及其转录目标基因CPT1A与ACOX1，从而抑制脂肪酸B氧化。也就是说，肝癌的发生发展有多种基因参与，其中部分基因的改变可以通过信号转导通路和（或）直接影响肝癌代谢网络，促进肝癌发生、发展。

Caroline等通过对比临床配对肝癌与癌旁组织样本的miRNAs，共发现有32种 miRNA有显著性差异，通过miRNA与基因（mRNA）的负相关富集分析及生物信息靶标预测，其中6种miRNA被预测具有靶标作用。肝癌中miR-26a、miR-122以及miR-130a下调，可使下游靶标基因上调，这些基因与肿瘤的异常增殖（DNA复制、转录、核苷酸代谢）密切相关；肝癌中miR-21、miR-93及miR-221上调，可使下游靶标基因下调，这些基因与代谢和免疫系统密切相关。如miR-122过表达可抑制PKM2的mRNA和蛋白水平，提高PKM2的表达后可解除miR-122对PKM2的抑制作用。

Xiaodong等发现，HULC是肝癌中过表达的长链非编码RNA，肝癌细胞中HULC可通过上调转录因子PPARα激活ACSL1启动子。miRNA-9可抑制PPARα，而HULC也可诱发miRNA-9启动子的CpG甲基化下调miRNA-9。HULC可刺激甘油三酯和胆固醇在细胞内蓄积。ACSL1过表达生成大量的胆固醇以促进肝癌细胞的增殖。胆固醇可通过视黄酸受体RXRA激活HULC启动子，从而正反馈上调HULC。近年来随着对肿瘤的研究进展，发现非编码RNA在肿瘤的发生发展中占据着重要地位，同时与肿瘤的异常代谢有着错综复杂的关系。其不仅可作为肿瘤的标志物，也可作为治疗肿瘤的干预靶点。

研究已知HBV相关的肝癌与脂质异常代谢密切相关，Ih-Jen等研究发现，乙肝病毒前S2基因突变在肝癌组织中显著升高，可导致脂质的双向累积，这种双向模式同时伴随ATP柠檬酸裂酶（ACLY）激活。进一步分析显示，前S2基因突变促使内质网（endoplasmic reticulum，ER）压力依赖mTOR信号通路瀑布反应，前S2基因突变诱导mTOR信号激活醇调节元件结合转录因子1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBF1）上调 ACLY，激活脂肪酸脱氢酶 2（ fatty acid desaturase 2，FADS2）可被ACLY依赖性蛋白乙酰化调停。同时，前S2突变通过真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白 1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，EIF4EBP1），Yin Yang 1（YY1）及骨髓细胞瘤致癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）激活转运蛋白家族2成员1（solute carrier family 2 （facilitated glucose transporter）member 1，SLC2A1）导致异常的葡萄糖摄取及乳酸生成，从而诱导mTOR依赖糖酵解通路异常导致代谢重构致使肿瘤形成。

Ping等研究发现，乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBX）在HBV相关肝癌中具有重要作用。HBX主要作用在DNA合成中的核苷酸代谢，结果显示HBX可影响葡萄糖、脂质、氨基酸代谢，尤其是核苷酸代谢，HBX诱导DNA损伤从而干扰核苷酸代谢，同时阻止DNA修复诱导肝癌的发生。另一方面，XiaoDong等通过生物信息学分析HBX下调mir-205致使脂质异常代谢。Mir-205通过靶点3′UTR抑制乙酰辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）的mRNA和蛋白水平。肝癌细胞中HBX可升高胆固醇水平（ACSL4的代谢产物），但可被mir205阻断，拮抗mir205后可升高细胞内胆固醇水平。因此，mir205可阻断ACSL4-mRNA，HBX可通过抑制mir-205导致肝癌细胞中胆固醇的积累引起脂质异常代谢。Zhang等Mir205作为肝癌的抑制子，mir205也可作用于细胞中的3′UTR下调肝脏中脂质异常代谢的关键酶乙酰辅酶A合成酶长链家族成员1（acyl-CoA synthetase long-chain family member 1，ACSL1）mRNA水平逆转肝癌脂质的异常代谢。抗mir205后，通过ACSL1致使甘油三酯蓄积。虽然在临床组织中低水平的mir205与高水平的ACSL1无关。但在HBX转基因小鼠中，HBX诱导的肝癌组织中ACSL1水平和甘油三酯水平显著升高。因此，mir205抑制ACSL1mRNA水平调停肝癌异常的脂质代谢。慢性乙型病毒性肝炎所致的肝癌可有多种因素参与。其中乙肝病毒引起的代谢异常，为肝癌的发生发展提供基础，同时为肝癌的发生、发展机制研究提供有力证据。

Liu等发现，缺氧蛋白可诱导RNA结合蛋白HuR与 miR-199a 转录物结合阻碍 miR-199a 成熟，从而抑制 miR-199a在糖酵解中对己糖激酶（hexokinase-2，Hk2）和PKM2的抑制作用，加快糖酵解。Regina等发现，PIM1在肝癌中高表达并且与肝外转移相关，在缺氧条件下PIM1可被显著上调。沉默PIM1可显著抑制肿瘤增殖与转移。敲除PIM1可显著减少葡萄糖摄取、降低p-AKT水平和糖酵解途径中的关键分子。Shi等发现，敲除miR-592可促进肝癌细胞的增殖，miR-592直接与WSB1（WD repeat and SOCS box containing 1，WSB1）的3′-UTR相结合，干扰缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）蛋白稳定性。相反，过表达WSB1可挽救HIF1a的低表达、葡萄糖摄取和miR-592介导的增殖抑制。说明，mir-592不仅是Warburg效应抑制剂，并且可以作为肝细胞癌治疗的靶标。缺氧是肿瘤微环境中最重要的组成部分，可通过促进肿瘤的异常代谢增加其恶性表型，即促进肿瘤的发生发展。

我们知道，一切生命活动都离不开新陈代谢，生命活动的任何改变最终都会反映于代谢产物的变化。肝癌的异常代谢产生的能量与合成原件为肝癌的恶性表型提供基础。虽然肝癌的异常代谢可受多重因素调节，但最终效应点依然作用在代谢产物上。因此，研究异常代谢的上游调控机制不仅为肝癌的发生发展机制研究提供有力依据，而且为肝癌的治疗提供科学依据，进而使我们更加系统地了解肝癌。

二、肝癌门静脉癌栓的代谢组学研究

肝癌患者门静脉癌栓（PVTT）发生率极高，50%～60%的肝癌患者首诊时就会通过影像学检查发现有门静脉癌栓形成。肝癌门静脉癌栓患者易发生肝内及肝外转移，因而预后极差，可以认为门静脉癌栓是反映肝癌转移的一种特殊表现。目前门静脉癌栓的发生、发展机制仍不明确，并且临床上的治疗手段已遇到瓶颈，因此迫切需要找出有效的治疗靶标或可用以早期诊断的生物标志物。

近年来，肿瘤的异常代谢主要集中在参与异常代谢的关键酶改变所致的代谢重构及影响；发现可用于早期诊断及预测预后的生物标志物；关于可逆转代谢重构的潜在药物研究等。其中，肝癌的代谢重构是主要的研究焦点之一。主要包括糖酵解代谢重构与脂质代谢重构。也就是说，肝癌通过代谢重构的方式，提供满足其快速增殖、转移所需要的能量及物质基础。研究发现，许多参与肝癌代谢重构的代谢酶、基因、非编码RNA和信号通路等的改变均与肝癌转移密切相关。因此，通过总结肝癌转移相关的代谢组学研究，为肝癌门静脉癌栓患者的早期诊断及治疗提供线索。

葡萄糖代谢主要分为糖酵解途径和磷酸戊糖途径（图2-11）。肝癌通过代谢重构进行并不高效的有氧糖酵解，为转移提供能量；同时增大磷酸戊糖途径的代谢流量，为转移提供物质基础。葡萄糖代谢流量的改变离不开关键酶的改变。

己糖激酶（hexokinase，HK）家族将葡萄糖磷酸化催化成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）。在HK家族中，HK2与葡萄糖的亲和力最高，并且在肝癌中高表达，具有保护肿瘤抗凋亡作用。通过对肝癌患者的临床资料分析发现，与肝癌预后差密切相关。He等通过整理15篇文章，共统计1932例消化系统肿瘤的荟萃分子中发现，肝癌 （HR = 1.87 ［1.58～2.21］，P＜0.001）并且与肿瘤大小、淋巴结转移、临床进展期等因素密切相关。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKs）是糖酵解中催化产生ATP和丙酮酸的最后一步，可配合HK和磷酸果糖激酶-1共同调节糖酵解途径的代谢流量。Wong等在肝癌细胞中敲除PKM2后在皮下荷瘤及原位肝移植的动物模型中发现。肺转移发生率明显减少。Liu等进一步发现，在肝癌组织中PKM2高表达组发生血管侵犯、肝内转移显著高于PKM2低表达组，并且总体生存期及无瘤生存期也明显低于PKM2低表达组。

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）可催化丙酮酸转化为乳酸。Liu等，回顾性研究683例肝癌患者的病例资料发现，肝癌患者术前血清中的高LDH与高AFP、HBV表面抗原（+）、大块肿瘤、大血管侵犯、淋巴结转移、肿瘤低分化、Child-Pugh B密切相关。同时也有研究发现，癌细胞中LDHA表达上调可促进糖酵解和降低肿瘤细胞的有氧依赖。在肝癌细胞中上调LDHA也可促进肿瘤的生长和转移。

FBP1是糖异生中重要的限速酶。肝癌中FBP1低表达与恶性程度高，预后差，易复发等密切相关。通过体内实验进一步证实FBP1与肝癌细胞的增殖、转移密切相关。针对瓦尔伯格效应的特效抑制剂-FX11可明显抑制FBP1丢失介导的肝癌恶性表型，FBP1不仅可以作为肝癌判断预后的生物标志物，也可作为潜在的治疗靶标。Cheng等通过对175例癌与癌旁配对的肝癌组织芯片染色发现FBP4在肝癌组织中低表达，通过分析临床资料，FBP4不仅与预后相关，而且与门静脉癌栓及肿瘤大小密切相关。并且通过体内外实验证明了FBP4可以抑制肝癌细胞的增殖、转移。

醛缩酶（Aldolase，ALDOs）是在糖酵解途径中可将果糖1-6二磷酸分解为3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的一种具有催化特性的关键酶。Zhou等利用313例肝癌组织芯片进行ALDOB免疫组织化学染色后分析发现，ALDOB的表达随着肝癌进展逐渐丢失，与肿瘤的包膜缺失、大小、复发等因素密切相关。而且ALDOB低表达患者预后较差，可作为独立风险因素存在。实验发现与在肝细胞系中过表达ALDOB可明显抑制体内研究的肝内转移、肺转移及循环肿瘤细胞。

葡萄糖6磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是磷酸戊糖途径（PPP）氧化途径中最关键的限速酶，在大多数哺乳动物物种中高度保守。Lu等研究发现，肝癌中G6PD高表达不仅预后差，并可通过上皮间质转化（EMT）促进侵袭，转移。同时在肝癌细胞系中敲除G6PD可显著降低其增殖、迁移、侵袭能力，并且认为G6PD可能成为潜在的调停转移及改善预后治疗靶标。

转酮醇酶（transketolase，TKT）是非氧化PPP途径中的关键酶，可使糖酵解的F6P（fructose-6-phosphate）和G3P（glyceraldehyde-3-phosphate）转移到PPP，以产生更多的核糖核苷酸，也可以生成大量的NAPDH抵消氧化压力。转录组测序表明，肝癌中TKT表达量最高且是上调最显著的PPP酶。TKT的表达与肝癌临床特征恶性度呈正相关（静脉浸润、肿瘤大小、肿瘤包膜缺失）。

Hamaguchi等人在汇集转录组数据后分析出14个糖酵解相关基因，其中8个基因为低氧诱导因子 -1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的转录靶点，包括 GPI、 ALDOA、 TPI1、GAPD、 PGK、PGAM、ENO1和PKM。对60例肝癌患者的临床资料进行分析发现，它们在肝癌伴有静脉侵犯的患者中表达明显高于肝癌不伴有静脉侵犯，并且预后显著较差。如前文所述，PIM1的表达在缺氧条件下可显著上调，相反可显著抑制肿瘤增殖与转移。

前文所述中一个是抗凋亡蛋白聚合酶（PARP14）可通过活化PKM2促进有氧糖酵解，还可以提高抗肝癌药物的敏感性。另一个是缺氧可通过抑制miR-199a，从而解除了对HK2和PKM2的抑制作用，加速糖酵解。

抑癌基因在肿瘤糖酵解中也有重大影响。研究发现在肝癌中的抑癌基因RAS相关糖尿病（Ras-related associated with diabetes，RRAD），是一种小分子Ras相关的GTP酶，它与代谢性疾病和多种癌症有关。Wang等发现，RRAD在肝癌组织中低表达，可以用于预测预后。进一步研究发现，RRAD可通过抑制GLUT1和HK2表达抑制有氧糖酵解，并且与肝癌细胞的侵袭、迁移呈负相关。

非编码RNA是不能转录成蛋白质的功能RNA。过去非编码RNAs在转录过程中被视为无用之物。然而，越来越多的证据表明非编码RNAs在各种生物过程中的重要作用，包括基因的转录和翻译。Burchard等人表明在肝癌中上调miR-122可减少乳酸生成和增加氧的消耗。随后的研究如前文中的miR-122可降低PKM2的表达，抑制糖酵解。

单羧酸转运蛋白（monocarboxylate transporter，MCT）可将肿瘤细胞中的乳酸加速输出到细胞外环境，以防止细胞内酸性物质蓄积所致的细胞凋亡。Gao等研究发现，MCT4过表达与肝癌的预后不良相关，并且进一步在体外研究中证实了，MCT4过表达与肿瘤增殖、迁移、侵袭密切相关。

酰基辅酶A中链合成酶3（Acyl-CoA medium-chain synthetase3，ACSM3）是参与脂肪酸代谢第一步的酰基辅酶A合成酶，Qin等研究发现，在肝癌组织中低表达，并且ACSM3低表达患者预后较差。进而通过体内外实验发现，过表达ACSM3可降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力。

脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN/FAS）是催化脂肪酸合成的关键酶，主要促进肿瘤细胞中内源性脂肪酸的生成。Geng Z等研究发现，FASN在肝癌组织中高表达，在肝癌细胞系中sh-FASN后可明显抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。Jiang等发现，8U是一种吖啶衍生物，已被证明具有有效的抗肝癌作用。生物学实验结果表明，8U可通过阻断PI3K/Akt通路，减少FASN蛋白表达，从而抑制细胞内脂质代谢紊乱，抑制肝癌细胞的侵袭和转移。

肝脏脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid-binding protein，L-FABP）在肝细胞中分布较多，主要参与脂质代谢。Lin等，通过对90例肝癌患者的癌与癌旁组织研究发现，肝癌组织中L-FABP高表达，并且与血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factors，VEGF-A）的表达密切相关。进一步研究发现，过表达L-FABP，可明显增加肝癌细胞在体内、体外的增殖、转移能力。

脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein，FABPS）是可溶性细胞内脂质结合蛋白（15 kDa），可结合多种维A酸和长链脂肪酸，并转运到细胞内，用于储存脂滴、运输和膜合成，以及转录调节。Takanori等通过研究243例肝癌患者组织中FABP5的表达情况，发现阳性表达患者的预后显著较差，并且与发生远端转移、肿瘤大小、血管侵犯密切相关。进一步在肝癌细胞中上调FABP5可促进增殖、侵袭和迁移，而FABP5下调可抑制肝癌细胞的体外增殖、侵袭和迁移。通过体内再次验证了FABP5在肝癌中促进增殖、转移的作用。

肝癌中miR-384普遍低表达，尤其是与HBV相关的肝癌。Kong等发现，癌基因-多效蛋白（pleiotrophin，PTN）是miR-384的靶标。HBX可抑制miR-384，增加PTN表达。PTN的受体N-聚糖在肝癌中也是高表达。有趣的是HBX诱导PTN通过N-聚糖促进细胞增殖、转移和脂肪生成。PTN介导的脂质合成在肝癌的增殖和转移中起着重要作用。PI3K/Akt和mTOR抑制剂可减少PTN诱导的增殖、转移和脂肪生成。

O-乙酰氨基葡萄糖转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）是唯一的参与代谢重构的糖基转移酶。Yu等研究发现，OGT在非酒精性肝硬化肝癌中普遍高表达，体内外实验表明，OGT高表达可明显提高肝癌的增殖、转移。OGT抑制剂可显著抑制肝癌的增殖、转移。

CD147是一种在多种肿瘤（包括肝癌）中高表达的跨膜蛋白。在癌细胞中促进糖酵解和抑制氧化磷酸化中起着重要作用。一方面，可通过激活AKT/mTOR信号通路上调固醇调节因子结合蛋白（sterol regulatory element binding protein 1c SREBP1c），进而直接激活主要的脂肪基因FASN和ACC1转录促进脂肪合成。另一方面，可通过激活p38 MAPK信号通路下调过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）及目标基因肉毒碱棕榈酰转移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）和乙酰辅酶A氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX1）的转录从而抑制脂肪酸的β氧化。最终通过体内外实验表明，CD147介导的脂肪酸代谢重构在肝癌细胞的扩散和转移中起到了至关重要的作用。

Zheng等将肝癌不伴PVTT（20例）、肝癌伴PVTT（20例）的肝癌组织进行蛋白裂解，用2D凝胶电泳分析。凝胶用考马斯蓝染色法显示蛋白质组图谱。在ImageMaster 2D软件的辅助下，在465个蛋白点中发现，肝癌不伴PVTT组织中有24个蛋白点上调，而肝癌伴PVTT的肝癌组织中有9个蛋白点上调。进一步用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）鉴定差异表达的蛋白质（表2-4）。其中肝癌伴PVTT组中的蛋白质二硫键异构酶A6 （protein disulfide-isomerase A6，PDI A6）及肝癌不伴PVTT组中的载脂蛋白A-Ⅰ（apolipoprotein A-Ⅰ，Apo A-Ⅰ）尽管在mRNA水平上未见明显差异，但在蛋白表达水平上存在显著差异。

Tang等为在血清小分子量蛋白中寻找出肝癌伴PVTT特有的生物标志物，分析了12例正常人、12例肝癌不伴PVTT、12例肝癌伴PVTT的血清。利用2D凝胶电泳，并用ImageMaster 2D软件分析。相较于正常血清，筛选出15个分子质量小于20kDa的蛋白点，用MALDI-TOF MS/MS鉴定，分析出脂蛋白CⅢ、L链载脂蛋白A-LI、B链转甲状腺素蛋白、DNA拓扑异构酶Ⅱ、α链结合珠蛋白-2等5个小分子蛋白（表2-5）。其中脂蛋白CⅢ、L链载脂蛋白A-LI、B链转甲状腺素蛋白、DNA拓扑异构酶Ⅱ在肝癌中低表达，α链结合珠蛋白-2高表达，同时相较于肝癌伴或不伴PVTT具有显著性差异表达的蛋白。

Pan等利用气相色谱/飞行时间质谱（gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC/TOFMS）对暴露于二乙基亚硝胺（DEN）建立的肝癌与肝癌肺转移（HCC with lung metastasis，HLM）大鼠模型的血清及尿液进行定量，用PLS-DA分析，在阴性对照组、肝癌组与HLM组均发现了差异性代谢产物（表2-6）。其中血清丝氨酸、苯丙氨酸、乳酸、酪氨酸和葡糖醛酸、尿甘氨酸、丝氨酸、5-羟脯氨酸、苹果酸、马尿酸和尿酸的权重最大。HLM组中核酸、氨基酸和葡糖醛酸的代谢明显增高。这些数据提示了潜在的肝癌侵袭和转移的代谢标志物。

肝癌转移作为预后不良最主要原因之一，不仅影响患者的生存质量，也给进一步治疗带来极大挑战。既往我们寄希望于通过研究基因、转录因子、信号转导通路、微环境等方面解释肝癌的转移机制，虽然取得了很多可喜的成果，由于肿瘤的易变性、差异性、多样性等特点使得研究成果临床转化受到了极大阻碍。代谢的改变作为多种因素（基因、环境等）变化后的最终体现，因此针对终末环节进行调控可能为肿瘤的治疗提供新视野。

经过学者们的研究发现，葡萄糖代谢途径（糖酵解途径、磷酸戊糖途径）及脂肪酸代谢途径中酶活的改变均参与了肝癌的转移。进一步研究发现，蛋白、基因、非编码RNA、信号转导通路的改变也有直接或间接参与转移相关的代谢重构，为研究肝癌的转移机制提供新思路。

通过总结发现，HK2和PKM2在肝癌中与转移相关已被证实，可受非编码RNA或基因参与调控其表达影响糖酵解，但与转移间关系需进一步证明。膜蛋白的表达也通过细胞膜的转运、信号转导影响着肝癌的转移。CD147可介导脂肪酸代谢重构影响肝癌的转移，MCT4是否也介导着代谢重构也有待研究。缺氧可直接影响多种代谢酶或通过基因和非编码RNA影响代谢酶，影响肝癌的血管侵犯或转移。而pH、炎症等微环境的改变对肝癌代谢重构所致转移的影响尚未被报道。脂肪酸代谢重构对肝癌转移影响的研究尚缺乏，比较分散，有待进一步研究。通过分析肝癌门静脉癌栓或转移相关代谢产物的改变，为预测肝癌转移提供线索，但理想的生物标志物是高表达类型的代谢产物，如甲胎蛋白。目前结果仍有局限，更谈不上转化应用于临床。这些侧面的说明了我们仍然还有很多工作需要共同攻克。

门静脉癌栓可以认为是肝癌转移的早期表现，由于肝癌门静脉癌栓的代谢组学研究尚不足，因此希望通过代谢重构对肝癌转移影响的研究中挖掘线索，进而可以找到肝癌门静脉癌栓发生、发展中的代谢重构中的关键环节，针对肝癌门静脉癌栓，找出最终靶点，并设计出相应的抑制（增强）剂逆转代谢重构，最终使临床肝癌患者获益。

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