第二节　肿瘤干细胞与肝癌门静脉癌栓

目前关于肝癌门静脉癌栓中肿瘤干细胞研究的相关文献较少。对于肝癌门静脉癌栓中是否有存在肿瘤干细胞、肿瘤干细胞是否导致门静脉发生等一系列问题还缺乏深刻的认识。然而目前肿瘤干细胞及肝癌门静脉癌栓的相关研究提示，肿瘤干细胞在肝癌门静脉癌栓的发生中可能具有比较重要的作用。本章节分别阐述了目前肝癌肿瘤干细胞和肝癌门静脉癌栓的相关研究，希望借此引发肝癌门静脉癌栓中肿瘤干细胞作用的相关思考。

一、肿瘤干细胞基本认识

肿瘤组织中存在一群具有自我更新、无限增殖和肿瘤起始能力的肿瘤细胞，由于其具有类似正常干细胞所具有的干细胞特性，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cell）。早期在血液系统肿瘤研究过程中，研究人员发现肿瘤细胞群中只有一小部分肿瘤细胞具有无限增殖的能力，并且在动物模型中能够诱导生成异质性肿瘤细胞群（图2-6）。

这个过程同正常干细胞增殖、分化形成正常的组织器官类似，因此这一小部分具有无限增殖能力、能够诱导生成肿瘤的细胞被称为肿瘤干细胞。这个概念在血液肿瘤领域中提出之后，相继在多种实体肿瘤中得到了验证。在肺癌、卵巢癌等实体肿瘤中，也只有少于0.1%的肿瘤细胞具有无限增殖、诱导生成肿瘤能力。这提示肿瘤干细胞具有较为广泛的适用性。后续研究发现肿瘤干细胞具有较强的抗放疗/化疗的能力，临床常规的肿瘤治疗方法通常不能够有效的清除肿瘤干细。因此，目前公认肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的主要因素，寻找靶向肿瘤干细胞的治疗方法是目前领域内的研究前沿与热点（图2-7）。

二、肿瘤干细胞与肝癌发生和转移

对于肝癌中肿瘤干细胞的研究有诸多报道，主要涉及肝癌干细胞鉴定、肝癌干细胞在转移中作用及相关的分子机制研究。

肿瘤干细胞的鉴定主要依据其所具有的干细胞特性。根据干细胞不能利用Hoechst 33342着色的特性，T．Chiba 利用侧群细胞分析方法（Side population （SP）cell sorting）发现在人肝癌细胞系huh7和PLC/PRF/5中只有0.25%～0.80%的肿瘤细胞具有SP表型，这群细胞在动物模型中具有比较强的诱导肿瘤生成能力。根据肿瘤干细胞自我更新、抗放/化疗及诱导生成肿瘤等特性，发现诸多表面分子标记可以用来分离鉴定肝癌干细胞。其中CD133是应用较为广泛的肿瘤干细胞标记之一，诸多研究报道肝癌细胞系中CD133阳性的肝癌细胞具有自我更新能力和较强的诱导肿瘤生成能力。CD24是通过小鼠化疗模型发现的，可以用来检测肝癌中具有较强抗化疗特性的肝癌干细胞。通过分子表达谱筛选得到的EpCAM可以鉴定具有较强致瘤能力的肝癌干细胞。我们的研究发现ICAM1分子可以用来鉴定具有较强转移能力的肝癌干细胞。此外，用于肝癌干细胞鉴定的分子还有CD90、CD44等分子（图2-8）。

这些分子的表达有的具有部分重叠，比如CD24阳性的肝癌干细胞中部分细胞表达CD133和EpCAM，有的则无重叠表达，又如EpCAM阳性肝癌干细胞不表达CD90。上述这些研究确认了肝癌组织中肿瘤干细胞的存在。另外，提示肝癌组织中的肿瘤干细胞包含多个具有不同表型的亚群。这些肝癌干细胞亚群的存在有可能是因为它们具有各自不同的细胞起源，也有可能是因为它们受到不同外界环境的影响表现出不同的分子表达特性，其具体原因还有待进一步的探讨。

肿瘤干细胞被看作肿瘤复发和转移的主要原因。常规肿瘤治疗方式能够清除绝大多数的肿瘤细胞，而肿瘤干细胞所具有的较强抗放/化疗特性使其能够在治疗后生存下来，其自我更新能力和诱导肿瘤发生特性导致治疗后肿瘤复发。肿瘤干细胞较强的转移和抗凋亡能力赋予了其诱导肿瘤转移发生的能力。相关研究发现，肝癌干细胞在浸润性肝癌组织的边缘有较多富集并且能够诱导模型小鼠发生肝癌肺转移。K19阳性的肝癌干细胞通过EMT获得间质细胞表型、高表达肝癌转移相关分子，提示在转移中发挥重要作用的上皮间质转化（EMT）过程参与了肝癌干细胞的转移和扩散。EMT促进肝癌细胞获得干细胞表型，提高肝癌干细胞抗放/化疗能力，进一步验证了其在肝癌干细胞诱导肿瘤转移中的重要作用。我们的研究发现肝癌干细胞还通过高表达转移相关蛋白分子如ICAM1及其相关非编码RNA来增强自身的转移能力。另外，肝癌干细胞还具有诱导肿瘤血管生成的能力。肝癌干细胞标记分子CD133、CD44等表达同肝癌的肿瘤血管生成程正相关性，其分泌的IL-8在诱导血管生成方面发挥着重要的作用。

上述研究从肿瘤干细胞的角度解释了肝癌发生、复发和转移的根本原因，证实了肝癌干细胞在肝癌发生和转移中的重要作用。揭示的相关分子机制为开发更加有效的肿瘤治疗方法提供新的方向。

三、肿瘤干细胞与肝癌门静脉癌栓关系探讨

关于肝癌门静脉癌栓的起源问题，目前主要认为其是肝癌细胞从原发肝癌逃逸进入血液循环系统，在门静脉定植形成的肿瘤转移灶。肝癌干细胞在肝癌门静脉癌栓的形成过程中是否发挥作用还未见直接研究证据。根据目前肿瘤干细胞研究与肝癌门静脉癌栓研究推测，肝癌干细胞有可能在门静脉癌栓发生中发挥着重要作用。

如前所述，肝癌干细胞在肝癌细胞的浸润和远端转移中发挥着重要的作用。在小鼠模型中，尾静脉注射的肝癌干细胞能够在小鼠的肺组织中形成肝癌转移灶，说明肝癌干细胞能够在循环血液中存活并保持诱导肿瘤生成的能力。肝癌患者外周血中能够检测到肝癌细胞，说明肝癌细胞能够离开肝癌组织原发灶，进入患者的外周血液循环系统。肝癌患者外周血中检测到肿瘤干细胞，进一步说明肝癌患者外周血中肿瘤细胞包含肝癌干细胞。这些研究为肿瘤干细胞能够进入血液循环提供了实验支持。

门静脉癌栓方面，我们早期的相关研究发现门静脉癌栓组织具有特定的miRNA分子表达谱，其中包括表达水平较高的miR-135a、miR-302d和miR-10b。根据研究报道这三个miRNA 分子分别同干细胞特性维持及干细胞恶性转化相关。miR-135a有助于精原干细胞的干细胞特性维持。miR-302d在胚胎干细胞中呈现高水平表达。miR-10b诱导正常肝脏干细胞通过EMT过程发生恶性转化。这提示在癌栓组织中可能存在具有干细胞特性的肿瘤细胞。在lncRNA的相关研究中，我们发现门静脉癌栓组织具有独特的lncRNA表达谱，其中癌栓组织中高表达的lncRNA-ICR能够调控肝癌干细胞中ICAM1的表达，影响肝癌干细胞的干细胞特性维持。其表达水平同肝癌患者门静脉癌栓的发生具有临床相关性。我们通过荧光染色的方法在门静脉癌栓组织中检测到了ICR/ICAM1双阳性的肿瘤细胞，进一步佐证了门静脉癌栓组织中肿瘤干细胞的存在。现在普遍认为缺氧微环境通过促进EMT发生、上调Oct4/Sox2/Nanog等干性相关基因等方式诱导肿瘤细胞区分化，维持肿瘤干细胞的干细胞特性。我们研究发现肝癌组织中的缺氧微环境能够诱导14-3-3ζ的表达，促进门静脉癌栓的发生。缺氧诱导的14-3-3ζ表达水平同门静脉癌栓的发生具有临床相关性，抑制14-3-3ζ的表达能够明显减少门静脉癌栓的发生。这提示肿瘤干细胞在门静脉癌栓的发生中发挥一定的作用。

上述研究分别从肿瘤干细胞和门静脉相关研究方面分析了肿瘤干细胞在门静脉癌栓发生中的潜在作用。揭示肝癌干细胞诱导肝癌门静脉发生的作用机制 还有诸多问题要进一步的探讨，比如借鉴目前肝癌组织肝癌干细胞的分离鉴定方法分离鉴定门静脉癌栓中的肿瘤干细胞、采用高通量组学技术分析癌栓组织来源肿瘤干细胞与肝癌组织来源肿瘤干细胞是否属于同一起源以及癌栓组织来源肿瘤干细胞所具有的独特基因表达谱等。这些问题的解决有助于揭示门静脉癌栓发生的起源问题，为门静脉癌栓特异诊疗提供理论依据带来了新的思路和新的希望。

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