以往的研究表明，miRNA主要参与造血、细胞增殖与凋亡、肿瘤生成等生物学过程。2005年Zhao研究小组发现 miR-1-1和 miR-1-2在心脏和肌肉组织中高表达，并且这种表达受到几个心脏和肌肉关键转录因子SRF、Mef2和MyoD的调控 ^［3］。这一研究说明miRNA对心脏基因具有调控作用，也为理解器官在形成时miRNA的调控作用奠定了良好的基础。

miRNA的生成始于细胞核，在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ作用下生成初级miRNA（pri-miRNA），随后被由RNA酶Ⅲ核酸内切酶Drosha和DGCR8（RNA结合蛋白DiGR8关键区域）组成的复合物剪切，产生含有一个茎环样结构的中间产物即前体miRNA（pre-miRNA）。输出蛋白5（Exportin 5）将前体miRNA转运至细胞质，在RNA酶Ⅲ核酸内切酶Dicer的剪切下，形成miRNA双链结构。双链中的其中一条链被降解，另一条链即成熟miRNA，其与argonaute蛋白以及Dicer结合，形成RNA诱导的沉默复合物RISC，发挥转录调控作用。除此通路外，还有一种不通过Drosha而仅通过Dicer的miRNA生成途径。

Dicer酶是pre-miRNA转变为成熟miRNA的关键酶。动物胚胎中敲除Dicer1可导致pre-miRNA无法成熟、多能干细胞失去其分化能力、胚胎生长停滞甚至死亡 ^［4］。心肌祖细胞特异性敲除Dicer1同样引起严重的心脏发育缺陷，在心脏发育早期易引起心肌发育迟缓、心包水肿、甚至胚胎死亡。而在心脏发育晚期，Dicer酶则参与心室间隔生成和流出道的发育。神经嵴细胞中条件性敲除Dicer酶，对神经嵴细胞迁移、定位影响不大，但却导致Caspase依赖的细胞凋亡途径被激活，交感神经和感觉神经元缺失。实验所使用的突变小鼠大多患有B型主动脉弓中断（type B interrupted aortic arch）、右室双出口（double outlet right ventricle）、室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD），食管后位右锁骨下动脉（retroesophageal right subclavian artery）和颈动脉异位（ectopic placement of the carotid arteries）等先天性心脏畸形。 miR-21以及 miR-181a诱导Erk1/2信号通路上调，能调控神经嵴细胞中特异性敲除Dicer酶引起的生物效应。

Dicer酶除参与胚胎发育过程外，其对维持新生儿心脏功能和结构的完整性也十分必要。组织特异性敲除Dicer酶不会导致胚胎死亡，但却能使新生儿心脏成熟miRNA水平显著降低，导致其最终死于扩张型心肌病与心力衰竭。而成年小鼠心肌细胞特异性敲除Dicer1则会导致自发性心肌重塑。Drosha-DGCR8复合体是pri-miRNA形成pre-miRNA的关键酶，在神经嵴细胞以及心肌细胞中特异性敲除DGCR8也会出现类似的心脏畸形。

miRNA在哺乳动物的胚胎发育过程中发挥着重要作用，其对心肌细胞分化及发育也起着重要作用。

发育早期，神经嵴细胞（neural crest cells，NCCs）由背神经管分离所得，形成一条略有起伏的细胞带，继而迁移分化形成外周神经系统、生黑色素细胞以及颅面组织。心脏神经嵴（cardiac neural crest，CNC）是来源于胚胎枕部耳板至第3体节间的一群神经嵴细胞，是由此迁移到心脏的干细胞。来源于颅脑枕部的神经嵴，与流出道、瓣膜、心脏传导系统、咽弓动脉发育等心脏形态发生过程密切相关。敲除小鼠胚胎心脏神经嵴细胞中的Dicer1会造成多重的心血管缺陷，这些异常包括双入口左心室、三尖瓣闭锁。由此可见，心脏神经嵴细胞与心脏锥干部的发育关系密切，miRNA可以干预心脏神经嵴细胞进而影响心脏发育。

多种miRNAs可以调控NCCs分化为平滑肌细胞。异位表达的 miR-145可通过表达与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）分化相关的基因诱导多功能神经嵴干细胞分化为VSMCs。 miR-145可促进心肌蛋白依赖的成纤维细胞转化为VSMCs ^［5］。 miR-143和 miR-145可以通过共同靶向作用于相关转录因子，如Klf4、心肌蛋白和Elk1等，调节VSMCs增殖分化。 miR-143靶向调控Elk1（促进血管平滑肌细胞增殖）， miR-145靶向调控心肌蛋白（促进VSMCs分化）以及Klf4和钙调蛋白激酶Ⅱ（促进细胞增殖），调控VSMCs的分化和增殖。这些结果表明 miR-143/145可能在调控平滑肌细胞的表型转换中发挥重要作用。 miR-143/145双基因敲除小鼠没有表现出任何心脏和血管畸形，但新生小鼠由于主动脉和股动脉的血管中膜缺损而表现出低血压 ^［5］。

miRNA在心外膜和心内膜发育过程中的调控作用还不完全清楚。但有研究发现心外膜Dicer1对于冠状动脉血管的发育起着重要作用。心外膜Dicer1特定缺失导致小鼠出生后立即死亡，主要表型是由于上皮向间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）受损而出现的冠状动脉血管缺陷和心外膜细胞增殖与分化降低。在这些突变的心脏中，心外膜细胞的EMT转化过程受到严重影响，并且EMT调节因子的表达也发生改变，Wt1、Snail1、Snail2和Twist1的表达减少，E-cadherin的表达增加；在冠脉血管发育中Dicer1在心外膜细胞增殖过程中显著下调。

多种miRNAs可以调节EMT的过程，其中包括 miR-21、 miR-31、 miR-103/107、 miR-155和 miR-200家族。在心外膜间质细胞中 miR-21可以通过靶向程序性细胞凋亡因子（programmed cell death 4，PDCD4）和快速发育生长因子同源物1（sprouty homolog 1，SPRY1）促进纤维化的发生。过表达 miR-21也会导致间充质细胞标志物E-cadherin表达减少。 miR-31可以通过直接抑制心肌祖细胞基因Isl1，抑制上皮细胞的EMT过程。 miR-23通过抑制其HAS2和细胞外透明质酸的产生抑制心内膜垫形成。在斑马鱼胚胎心脏中， miR-23基因的表达缺失会导致心内膜垫的细胞分化。研究还发现 miR-23b在孕早期室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）胚胎心肌组织中上调4.4倍，在孕中期VSD组织下调3.5倍。说明 miR-23b可能调控转化生长因子β（TGF-β）、Notch、Wnt信号通路； miR-23b可以抑制鼠的内皮细胞TGF诱导的EMT过程，这提示 miR-23b表达下调对于心肌细胞的成功分化是必要的。 miR-218不但可以调节血管的发育，敲除 miR-218后也可以降低心脏内膜的迁移率抑制心脏发育过程。以上研究表明miRNA在心外膜与心内膜发育过程中具有重要作用。

很多miRNAs被证明是心肌细胞发育的关键调节因子，对心脏的表达、发育调节以及出生后心脏功能的维持都十分重要。

miR-1是一种进化保守，且在心肌、骨骼肌高度富集的miRNA。miRNA测序显示， miR-1在哺乳动物心脏表达最为丰富，约占心脏总miRNAs的40%。研究发现，血清反应因子（serum response factor，SRF）、肌细胞增强因子-2（myocyte enhancer factor-2，Mef2）、MyoD、肌细胞生成素（myogenin）以及NKX2.5等肌源性转录因子可调控肌肉特异性 miR-1。 miR-1可下调Tinman（无脊椎动物中NKX2.5的直系同源基因）下游的Cdc42，这种调控关系影响新生果蝇心脏收缩、电传导和节律维持。Irx5是一个调节KCND2的同源结构域转录因子，参与心脏复极过程。有研究显示 miR-1-2突变小鼠心脏电生理缺陷与其靶向调控iroquois同源盒5基因（iroquois homeobox 5，Irx5）有关 ^［3］。此外，有研究发现 miR-1可促进心脏祖细胞和骨骼肌祖细胞的最终分化 ^［6］，并维持胚胎横纹肌正常发育，过表达可导致心脏前体细胞的过早分化。敲除 miR-1的心肌细胞则会出现严重的肌节紊乱， Telokin、 Myocardin、 Acta1、 Acta2、β -MHC/MYH7等平滑肌特异性基因显著上调，并且出现心力衰竭和心室异常，进而使胚胎发育受阻。Hand2是一个与心脏分化相关的心源性转录因子。 miR-1可靶向抑制Hand2的表达，显著降低心肌细胞的增殖能力，使心肌细胞过早出现周期停滞。

胚胎发育期间， miR-133a可以靶向抑制SRF和cyclin D2编码基因，对于心脏收缩基因的表达和心肌细胞增殖起着重要的调控作用，还可促使新生儿心肌细胞过早退出细胞周期。 miR-1和 miR-133a具有不同的序列，很可能调控不同的靶基因，从而具有不同的生物学功能。但在心脏发育过程中，两者行使的功能仍有部分重叠。如Hand2可被 miR-1调控，同时也是 miR-133a的靶点。同时敲除 miR-1和 miR-133a，会导致更严重的肌节肌动蛋白排列紊乱、血液循环和心脏功能严重受损，这与 miR-1/133a复合物敲除导致心肌细胞分化因子（myocardin）上调有关，而心肌细胞分化因子正是平滑肌基因表达的主要调节分子。因此， miR-1/133a突变在胚胎心脏发育的早期阶段，例如中线性管状心脏的形成没有影响，而心肌细胞却难以成熟，很难表达心肌和平滑肌特异性转录本。

综上， miR-1/133a双顺反子簇在空间和时间上介导基因表达的过程十分复杂，其广泛参与心脏电传导和节律维持、肌节的发育、细胞周期的调控以及未成熟的心肌细胞转向更成熟的表型等过程。

miR-17-92基因簇，亦称为OncomiR-1，是一种高度保守的多顺反子转录物。 miR-17-92簇通过负调控肿瘤抑制因子PTEN来促进胚胎、新生儿和成人心脏的心肌细胞增殖。此外其对于第二生心区的心肌祖细胞的分化具有重要作用，影响右心室和流出道的正常发育。胚胎发育相关转录因子ISL-1和T-box转录因子1（T-box transcription factor，Tbx1）是第二生心区发育的标记蛋白，这两种转录因子在第二生心区未分化的前体细胞中高表达。敲除BMP2/4，将抑制pri- miR-17-92，导致Tbx1表达下调，造成心脏发育缺陷。 miR-17-92缺失引起Bim等促凋亡蛋白的上调，胚胎出生后不久就死于室间隔缺损和肺发育不全 ^［7］。此外，同时敲除 miR-17-92和 miR-106b-25将导致心室发育不良、心房和心室中隔缺损、血管充血、水肿等一系列严重的心血管疾病 ^［8］，严重时可导致胚胎死亡。 miR-92能影响斑马鱼内胚层以及心脏二分叉（cardia bifida）的形成，而特异性敲除 miR-92则引起左右心不对称。

此外， miR-17-92簇成员还参与调节器官大小。全身过表达 miR-17的转基因小鼠与其同窝对照小鼠相比，体型更小；同时心脏、肝脏和脾脏重量显著降低，这可能由于 miR-17抑制纤维连接蛋白的表达。然而，在小鼠发育中的心肌细胞过表达整个 miR-17-92簇，导致心脏增生、肥大，并在约2月龄时引起猝死。可见 miR-17-92簇的成员具有不同的功能，每个单独的miRNA在心脏发育和功能方面的调节作用仍需进一步研究。

miR- 15家族表达于人类各组织器官中，其家族成员包括 miR-15a、 miR-15b、 miR-16、 miR-195、 miR-424、 miR-497等，其可以通过抑制细胞周期调控因子来抑制心肌细胞增殖 ^［9］，亦可靶向抗凋亡因子Bcl-2诱导细胞凋亡。哺乳动物胚胎形成时期，心肌细胞大量增殖，出生后随着闰盘的成熟以及肌原纤维密度的增加，出现细胞周期停滞，心肌细胞体积增大。此时多个 miR-15家族成员表达明显上调，其中 miR-195在此过程中变化最为明显。 miR-195可通过靶向抑制检测点激酶1（checkpoint kinase 1，Chek1），影响DNA修复和有丝分裂 ^［10］。 miR-590和 miR-199 a可以促进新生的和成年啮齿动物的心肌细胞增殖。 miR-320通过下调热休克蛋白20的表达诱导心肌细胞凋亡。另外 miR-98、 miR-128和 miR-142可以直接调控TGF-βR1抑制TGF的活性，影响心肌发育，损害胚胎发育鼠的心肌细胞增殖和活性。同时 miR-15家族成员体外可直接靶向细胞周期相关的几个重要蛋白：cyclin D1、cyclin D3以及cyclin E。E2F是肿瘤抑制蛋白pRb的下游因子，可通过在细胞周期调控基因的启动子促使异染色质的形成，从而将胚胎心肌细胞维持在有丝分裂阶段。研究人员通过研究多种肿瘤细胞发现，E2F可直接靶向于 miR-15和 miR-16簇。但 miR-15家族、E2F与cyclin E的靶向调控关系在心脏发育中的作用，仍有待进一步实验探究。

肌球蛋白是心肌的重要组成部分，与心肌收缩相关。心脏收缩主要取决于α和β两种肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）的表达，这两种MHC受发育和病理信号的调节，其中β-MHC/MYH7是胚胎心脏中主要的肌球蛋白亚型。α-MHC/MYH6在产后初期的啮齿类动物体内显著上调；与此相反，β-MHC在成年人类和其他大型哺乳动物体内高表达，这表明肌球蛋白的调控作用具有种属特异性。

myomiR是脊椎动物特异性miRNA家族，能够调节部分肌球蛋白亚型。该miRNA家族包括 miR-208a、 miR-208b以及 miR-499，他们由MYH6、MYH7内含子编码，与MYH7b密切相关。 miR-208b和 miR-499在小鼠胚胎发育期间高度表达，而 miR-208a在小鼠出生后快速上调。

小鼠心脏发育并没有明确需求某个myomiR，单独敲除 miR-208a、 miR-208b或 miR-499的小鼠在断奶前并未表现出明显的发育异常以及心肌收缩缺陷 ^［11］。然而 miR-208a敲除动物在约2月龄时心脏功能逐渐下降，6月龄时出现肌节结构异常及骨骼肌特异性基因异位表达。

成熟的心肌细胞 miR-138通过介导ALDH1a2（视黄酸合成的必需物质）的下调，以及房室管处espg2的上调，调控心脏瓣膜的形成。 miR-138缺失后，房室管处心肌细胞大小无法增加，只能保持在一种圆形、不成熟的状态 ^［12］。

miR-218a-1和 miR-218a-2是哺乳动物 miR-218家族两个高度保守的miRNA，分别位于 slit3和 slit2基因的内含子处； miR-218b是鱼类 miR-218家族的第三个成员。 miR-218功能的缺失，会抑制心管形成过程中心脏祖细胞向中线的迁移，并导致严重的心包水肿和心脏形态缺陷 ^［13］，而敲除robo1则可缓解这一现象。可见， miR-218是通过靶向抑制robo1调控心脏祖细胞的迁移。

最近研究表明 miR-10a通过下调GATA6的表达，抑制心肌祖细胞增殖，但对其分化为心肌细胞并无太大影响。TBX5已被证实参与先天性心脏病的发病， miR-10a和 miR-10b可靶向抑制TBX5，参与心脏的发育过程 ^［14］。此外， miR-29通过介导Igf1、Imp1、Mest的表达，减缓心、肾、肝、肺等生长，并最终使机体停止生长。

miR-1-2突变小鼠心脏电生理缺陷与其靶向调控Irx5有关，其心电图表现为PR间期延长。 miR-208b和 miR-499在小鼠胚胎发育期间高度表达，而 miR-208a在小鼠出生后快速上调。单独敲除 miR-208a、 miR-208b或 miR-499在小鼠断奶前并未表现出明显的发育异常以及心肌收缩缺陷 ^［15］。但 miR-208a敲除动物在约2月龄时心脏功能逐渐下降，6月龄时出现肌节结构异常、骨骼肌特异性基因异位表达。miR-208a可调控缝隙连接蛋白40（connexin 40，Cx40）以及GATA结合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）、唯同源异型结构域蛋白（homeodomain-only protein，Hop）等与心脏传导相关转录因子 ^［16］。因此 miR-208a基因敲除小鼠的心电图缺乏P波，心房去极化和收缩受到影响。与此相反，过表达 miR-208a的成年小鼠心脏传导性并未改变。心肌特异性miRNAs家族成员的电生理功能仍有待进一步实验阐明。

Das发现 miR-181c聚集在细胞质中，最后转移至心肌细胞的线粒体中，调控线粒体基因组表达。新生大鼠细胞过表达 miR-181c可以降低其靶基因细胞色素c氧化酶1（mitochondrial cytochrome c oxidase 1，mt-COX1）的蛋白水平，增加mt-COX2的mRNA和蛋白水平，进而增加心肌细胞线粒体呼吸作用和活性氧的产生，导致电子传递链复合物Ⅳ重塑和线粒体功能障碍 ^［17］。

miRNA在物种进化的过程中高度保守，并在心脏发育以及心脏多种生理功能的调节中发挥关键作用（图4-1）。同时，miRNA直接或间接参与心脏发育缺陷性疾病的发生发展，其表达谱的变化也逐渐成为反映生物体状况的重要标志物。miRNA对蛋白组成的调控和修饰成为研究生物复杂性和潜在多样性的重要内容，对miRNA的深入研究将会给心脏发育缺陷性疾病的治疗带来新的靶点以及治疗手段。miRNA具有低复杂性、高亲和性、无需后加工修饰和组织特异性表达等特征。近年来，循环系统中miRNA的发现更进一步体现其稳定性和可监测应用性，为很多疾病的诊断和治疗开启新思路。但是miRNA对心脏发育和疾病猝发的调控机制还不十分清楚。目前，miRNA功能研究发展较为局限，主要因素是难以确定起关键作用的靶mRNA，因此，在目前的研究基础上，开发和结合更多生物预测软件对miRNA的靶标进行生物信息学预测，明确其调控网络，然后做进一步的系统验证，将更全面地完善miRNA研究体系。有研究显示体外预测靶标可能会出现假阳性，不能准确反映生理状况，因此需要探索更为有效的实验方法，这不仅需要将miRNA研究更多地聚焦于生物体，同时也需要结合有效方法提升miRNA的体内特异靶向作用。目前靶向研究主要针对单个miRNA的作用而忽略了miRNAs间的相互作用以及多种miRNA重组、结合发挥的调控作用，因此，对同一靶标起作用的多个miRNA相互作用以及进行重组后的研究也是需要深入探究的方向。尤其对于心脏发育这一复杂过程，miRNA调控网络研究更为重要。与此同时，随着研究的深入，miRNA的干预性应用也将成为药物制剂领域的研究热点。