1993年，Lee等报道了人类第一个miRNA： lin-4可通过与其靶基因 lin-14的3′UTR结合转录后抑制lin-14蛋白的表达，抑制秀丽隐杆线虫的发育。这一研究结果奠定了miRNA转录后调控蛋白质生物合成的生物学功能，也掀起了科研工作者对这一领域的研究热潮。随着新技术的不断发展，科学家对miRNA的认识也不断加深。人们发现，miRNA的生物学功能其实是十分复杂的：它们不仅可以在转录后水平调控靶mRNA的翻译过程，也可以诱导mRNA本身的降解；不仅可以调节编码基因，也可以调节非编码基因；不仅可以独立调节基因的表达，也可以与其他调节因子协同或拮抗发挥作用。miRNAs这种复杂的生物学作用模式使其在维持生物正常功能中发挥了不可替代的作用。

人们对miRNAs调节基因表达的最初认识是miRNAs通过其种子序列（seed sequence；5′端2～8位碱基）转录后抑制靶基因的蛋白翻译过程。随着研究的深入，科学家们发现有些miRNAs与靶基因（mRNA）3′UTR（3′末端非翻译区）碱基互补并以氢键结合，通过降解靶基因mRNA而抑制蛋白的生成。2009年，威斯康星大学Nick Ingolia和Jonathan Weissman教授开发了全基因组核糖体分析（ribosome profiling，Ribo-Seq）技术。采用这一方法进行全miRNAs功能分析发现：在哺乳动物中只有约6% ～26%的miRNAs是通过转录后抑制作用来干扰蛋白质的生成，66% ～90%的miRNAs是通过降解mRNA来发挥作用的 ^{［25，26］}。到目前为止，科学家发现miRNA对基因的表达调控是全方位的。根据作用方式不同可分为：①通过不完全互补配对抑制靶基因的翻译过程，不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度）；②与靶标基因完全互补结合降解靶基因mRNA，从而抑制基因表达，但这种情况只在植物细胞中存在；③全能型。当与靶标基因完全互补结合时，直接降解靶mRNA；当与靶基因不完全互补结合时，起着蛋白翻译抑制的作用，但也有研究认为，在种子序列配对的基础上，只要miRNAs 5′端第11～12核苷酸中任何一个能够与靶基因配对，便有很大的几率导致mRNA降解；④在特定的细胞状态下，miRNAs可以激活mRNA的翻译过程，上调基因表达 ^{［27，28］}。

在真核细胞中，由RNA聚合酶作用下转录生成的初始转录本mRNA（precursor mRNA）需要在5′端加帽（m ⁷Gppp）、3′端加尾（poly A）、切除内含子/拼接外显子（剪接）形成成熟的mRNA。然后，poly-A结合蛋白（the poly-A binding protein，PABP）与帽结合蛋白（cap-binding complex，CBC）结合形成环形结构保护mRNA分子不被核糖核酸酶降解，并从核内转运至细胞质内附着在核糖体上启动mRNA的翻译过程。miRNA对mRNA的调节离不开mRNA原有的转录调节机制，但是目前关于miRNA是如何调节其转录后抑制mRNA的机制仍然处于推测和假设的阶段。在细胞质中生成的单链成熟miRNA与GW182结合形成miRNA介导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complexes，miRISCs）的核心区，之后复合体中的miRNA与argonaute（AGO）蛋白结合（在哺乳动物主要是AGO2蛋白），共同引导RISC识别目标mRNA中的互补序列（主要在3′UTR），并以碱基互补的方式与后者结合 ^{［21，29］}。一旦mRNA与AGO2结合并招募去腺苷酶PAN2-PAN3到PABP和GW182 SD的结构域，细胞质内的TNRC6蛋白即可以与AGO2和PABP结合，阻止PABP与CBC结合。一旦CBC从复合体上脱落下来，即可暴露5′-cap，抑制蛋白质翻译的起始阶段。这一结果直接导致核糖体的脱落，并进一步导致PABP的释放，暴露3′polyA尾，在去腺苷酶PAN2-PAN3作用下poly-A尾部开始脱腺苷降解。当polyA降解到一定的长度后，去腺苷酶CCR-NOT complex开始降解polyA。继而引起脱帽因子DDX6，PATL1与CCR-NOT complex结合，脱帽酶DCP2以及其他辅助因子（包括EDC3、EDC4、PATL1、DDX6）结合到mRNA 5′cap，并开始脱帽。5′端帽结构被脱掉，并直接进入P-body。在P-body内，mRNA在DCP-1/2和CCR4-NOT等脱腺苷蛋白的作用之下脱帽以及脱腺苷，mRNA稳定性下降并被迅速降解 ^{［21，30］}（图2-5）。

miRNA对mRNA的这一调节过程似乎体现了先抑制后降解的时序性，但是到目前为止并没有研究显示其明确的时效关系 ^［31］。此外，长期以来miRNA是否影响翻译的延伸和终止过程一直处于争议阶段。直到2009年ribosome profiling技术的出现才使得我们能够准确获得mRNA翻译的不同阶段miRNA ^{［25，26，32］}。Ricci等研究发现，在不存在miRNA降解mRNA机制的条件下，用蛋白酶抑制剂阻断蛋白质翻译的不同阶段时发现，miRNA并不作用于翻译延伸过程，也不降解裸露的肽链 ^［33］，这一结果在很大程度上回答了长期以来对于miRNA能否抑制翻译过程存在的争论。

由于通常情况下正在翻译的mRNA编码区由核糖体覆盖，不利于miRNA对mRNA的识别，因而miRNA靶点预测倾向于在3′UTR进行，忽略了在其他位置miRNA与mRNA结合的可能。已有实验证实，miRNA还可以作用到mRNA的编码区（ORF）和5′UTR ^［34-39］。甚至，miRNA可以与启动子序列结合激活基因表达。研究表明在人的HeLa细胞系，将秀丽隐杆线虫 lin-41的3′UTR上的 let-7的互补序列插入到含有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites，IRESs）蛋白5′UTR和3′UTR的萤光素酶报告基因质粒，内源性 let-7a对插入5′UTR和3′UTR的靶基因的萤光素酶活性的抑制作用无差异，说明miRNA与mRNA间序列的互补程度虽然影响miRNA调节基因表达的效率，但两者结合的位置对miRNA的抑制作用并无影响，miRNA似乎不存在选择作用5′UTR还是3′UTR的机制。同样，也有证据表明，miRNA也可与基因的编码区靶位点结合发挥其调节蛋白表达的功能 ^［40-42］。

miRNA特异性识别结合靶mRNA是通过碱基互补的方式实现的。这就意味miRNA可通过此种方式去识别任何一段与之互补的RNA序列，其中包括miRNA。2004年，美国加州大学伯克利分校的Eric C. Lai课题组采用史密斯-沃特曼的算法（Smith-Waterman algorithm）结合打分矩阵分析线虫、果蝇和脊椎动物。发现果蝇中，miRNA间的互补主要涉及K-box家族的miRNAs包括 miR-6-1、 miR-6-2和 miR-6-3，这些miRNA与 miR-5有互补关系； miR-9a， miR-9b和 miR-9c与Brd-box家族中的 miR-4和 miR-79存在互补关系。并且miRNA-miRNA的互补程度大于miRNA与其靶mRNA 3′UTR的互补程度，同样具有保守性 ^［43］。有趣的是，miRNA：miRNA的互补序列往往来自于pre-miRNA的反向臂端。如 miR-9的成熟序列来自于其pre-miRNA的左侧臂，而 miR-4和 miR-79的成熟序列则来自于其pre-miRNA的右侧臂。随后，通过采用全基因组靶点预测分析发现，miRNA-miRNA的互补关系普遍存在于多种物种中，这些具有互补关系的miRNA既可以存在于一个同源的基因组中（常见于人）或簇集在一个基因簇中（常见于大鼠），也可以位于不同基因组区（主要是人 hsa-mir-548家族） ^［44］。值得一提的是，相互结合的两种miRNA表达水平大多相反，如果一种miRNA高表达，与它结合的miRNA的表达则很低，这一现象提示一种miRNA可能具有调节另一种miRNA生成的作用 ^［45］。然而，问题是这种miRNA成熟体之间的直接互补关系如何实现彼此之间的调节作用？是未来研究的挑战。

2012年，Tang R等第一次在实验中发现，在小鼠细胞核中， miR-709可以直接与 pri-miR-15a/16-1结合，通过调节 miR-16的生成影响其表达，而不是影响 pre-miR-16到成熟 miR-16的过程或直接降解 miR-16 ^［46］。 miR-709属于一种鼠特异性的miRNA，主要存在于细胞核中。那么，是否只有存在于细胞核中的miRNA才具有直接调节其他miRNA的作用？这一作用是普遍存在还是在某一特定条件下发生？miRNA是否可以在细胞质中通过阻止pre-miRNA生成成熟的miRNA调节其他miRNA的生成？这些都是未来需要解决的问题。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类由大于200个核苷酸组成的非编码RNA。与miRNA一样，lncRNA也能够在转录和转录后水平调节基因表达，并广泛参与细胞的增殖、发育、分化、凋亡和疾病的发生发展过程。lncRNA的生成表达与编码RNA极为相似，核内生成后被转运到细胞质。miRNA是否同样能够作用于lncRNA调节lncRNA的表达呢？2011年，丹麦奥古斯大学Kjems课题组第一次报道了关于miRNA对lncRNA的调节作用 ^［47］。课题组在无内含子基因CDR1（cerebellar degeneration-related protein 1）启动子近端区域筛选具有转录水平基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）功能的miRNA的靶点时发现， miR-671序列与CDR1天然反义转录本（natural antisense transcripts，NATs）碱基序列几乎完全互补。随后研究发现这段CDR1 NATs在形成的过程中其3′端外显子和5′端外显子直接连接形成环状结构，形成环状的lncRNA： CDR1 AS。 CDR1 AS具有稳定CDR1 mRNA的作用。研究发现在细胞核内， miR-671可以与 CDR1 AS结合，并在AGO2存在的情况下降解 CDR1 AS，从而解除 CDR1 AS对CDR1 mRNA的稳定作用，间接地抑制了CDR1的蛋白表达水平。随后陆续有研究证明了miRNA和lncRNA之间的相互作用。如在人类子宫颈癌细胞中， let-7b过表达协同RNA结合蛋白（RBP）HuR和AGO2促进 lincRNA-p21的降解。 let-7b和HuR下调促进 lincRNA-p21的表达， lincRNA-p21通过与其靶基因JunB和CTNNB mRNAs结合，抑制JunB和β-catenin的翻译过程 ^{［48，49］}。 let-7b也可在HuR的协助下下调lncRNA HOTAIR的表达，并最终导致E3连接酶底物蛋白ataxin-1和snurportin-1蛋白的泛素化 ^{［49，50］}。此外， miR-9上调可以抑制lncRNA MALAT1的表达，在结肠癌细胞系中 miR-211可以抑制 LOC285194的表达，在甲状腺癌细胞系中 miR-574-5p靶向抑制 PTCSC3的表达 ^［51］。有趣的是这一过程都是在AGO2-RISC的协同下完成的。值得关注的是，一个lncRNA可以受到多个miRNAs的调控，如有报道在人胚胎干细胞 miR-145-5p、 miR-181a-5p、 miR-99b-3p均可以靶向调节 lincRNA-RoR的表达；在C2C12成肌细胞中，H19存在5个 let-7靶点（ let-7a、 let-7b、l et-7g、 let-7i、 let-7）与H19反向调节肌管的形成 ^［49］。这些研究结果均表明miRNA对lncRNA具有负性调控作用。以上这些实验结果都是在细胞系水平验证的。在体内，miRNA是否也能有效调节lncRNA稳定性，其异常是否能够导致病理过程的发生还需进一步验证 ^［49］。然而，miRNA对lncRNA是否具有正性调控作用？一个miRNA是否也可以调节多个lncRNAs，这些问题均有待于进一步的研究。

大量不同物种全基因组范围内靶点预测显示miRNA和靶基因之间并非一对一的关系，单个miRNA同时拥有数百个靶标mRNAs。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）代谢通路预测结果进一步表明由单个miRNA靶向结合的mRNAs经过GO注释后可以参与同一或不同病理生理过程。随后生物学研究证实：向HeLa细胞转染miRNA后，基因芯片分析发现数百个mRNAs表达水平发生改变。在去分化的小鼠成纤维细胞成分中， miR-302/ miR-294家族和 miR-181家族可以调节25个基因 ^［52］。这些研究表明单个miRNA水平的变化可以导致众多的mRNA水平的变化，但是这些结果并没有能够证明改变的mRNA是miRNA的直接作用还是间接作用。尽管如此，这些结果仍然揭示了miRNAs对生物体基因表达调控网络的复杂性，也提示其在细胞面对外界改变或细胞内环境波动时对维持细胞或生物体的稳定性可能具有重要的作用。

虽然miRNA靶点预测表明单个miRNA可与数百个mRNAs存在碱基配对互补关系，但靶mRNA的二级结构，内源性mRNA竞争物如circular RNA（circRNA）和lncRNA的水平也会干扰miRNA与靶mRNA的结合。这就使得基于计算机预测的靶点并不一定会产生真正的生物学意义。目前已有一些研究证明了同一个miRNA可以通过作用于不同的靶基因参与同一或不同的生物学过程。如： miR-290～295和 miR-371～373家族种子序列有6个相同的序列。研究发现在多形性胚胎干细胞（pluripotent embryonic stem cells，ESCs）中， miR-290～295家族通过靶向p21和Lats 2抑制细胞增殖；靶向Caspase 2促进细胞凋亡；靶向抑制Lefty1和Lefty2促进细胞的发育。科学家同时证明了 miR-290～295和 miR-371～373家族在ESCs的增殖、存活和自我更新方面发挥重要作用 ^［53］。 let-7是第一个被发现具有转录调节功能的miRNA。研究发现，线虫缺失 let-7家族可以导致线虫停滞在幼虫阶段，这一过程是由于 let-7缺失上调lin-28和daf-12的表达，反过来上调的lin-28会反过来抑制 let-7的表达。此外， let-7亦可以通过抑制Igf2bp1、Igf2bp2、Hmga2和N-myc共同参与线虫细胞的生长、增殖和代谢过程 ^［53］。最近研究发现，单miRNA或miRNA家族不仅可以通过多靶点调控的方式参与生物体的发育和增殖过程，亦可通过调节多靶点，以级联反应的方式调节疾病发生过程的特定的病理过程。如在大鼠体内 miR-195通过调节淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、β分泌酶1（beta-secretase 1，BACE1）、p35、PP2A甲基酯酶-1（protein phosphatase methylesterase-1，PME-1）参与β淀粉样蛋白（Aβ）沉积、Tau蛋白过度磷酸化的过程，在诱发老年痴呆过程中发挥作用 ^{［5，54，55］}（图2-6）。

然而，尽管一些生物学研究在一定程度上证明了单miRNA调节多基因的生物学意义，这些研究也只是冰山一角。要想真正绘制单miRNA靶向几百个目的基因的全貌仍需要科研工作者不懈的努力。此外，在众多的靶基因中，某一特定的miRNA是势均力敌作用于所有的靶基因，还是选择性的主要作用于某一个或几个mRNAs？如果是前者，它是如何实现这庞大的调控网络的？如果是后者，它选择的标准又是什么？

研究发现有61%的miRNAs以多顺反子簇的形式存在于一个初始基因转录本，编码不同的miRNAs。这些miRNAs簇由一个共同的启动子转录而成。目前研究比较多的是 miR-17-92簇。研究发现， miR-17-92簇在细胞发育过程中发挥重要作用，并广泛表达在肝脏、心脏和脑组织中。转录因子c-myc和E2F1-3可促进 miR-17-92簇的表达，而 miR-17-92反过来可以抑制E2F1-3、p21和Bim增殖，促进凋亡的发生，形成一个负反馈的调节网络。

由于miRNA在不同组织、细胞或不同时间表达不同，多miRNAs对单基因的调节作用没有在特定的生物过程中得到证实。直到近期，通过同时转染多个miRNAs到细胞中的实验，证明多个miRNAs可通过协调、拮抗（或允许作用）调节单基因的表达参与某一生物过程。例如，在肝癌细胞中， let-7c、 miR-200b，、 miR-222和 miR-424均可以结合 PBX3，通过抑制PBX3的表达，抑制肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）向肿瘤启动细胞（tumour-initiating cells，TICs）的特征转化。有趣的是，虽然这四种miRNAs单独转染均具有足够抑制TICs特征形成的作用，但敲减任何一种miRNA，其他三个miRNAs对PBX3的抑制作用都会消失，这说明，这四种miRNAs是以协同的方式共同调节PBX3的表达。此外，多miRNAs之间除了可以相互促进协同沉默基因表达，一种miRNA还可以拮抗另一种miRNA的功能以维持靶基因表达水平的稳定。 miR-184和 miR-205是在角膜上皮中高表达的两种miRNAs，它们可以结合到 SHIP2基因3′UTR不同的位点。 miR-205抑制SHIP2的表达，而 miR-184与 SHIP2结合不仅不抑制SHIP2的表达，相反，却可以消除 miR-205对SHIP2的抑制作用。这是第一次在脊椎动物中发现一种miRNA可拮抗另一种miRNA的功能。

阐明多个miRNAs对单基因的调控作用规律具有很重要的生物学意义，然而需要解决的问题仍然很多。如：在特定生理或病理条件下多个miRNAs对单基因的调控是如何实现其协同作用和拮抗作用？这种调控关系具有怎样的规律？在药物研发中会给我们怎样的启示？