生物在进化过程中获得的性状或细胞功能总是以其最精细和最完美的形式展现出来，miRNA的生物合成过程也是如此。miRNA的生物合成过程与其在基因组的位置和特性有关，其在基因组中既可以存在于基因间隔区（intergenic regions）也可以存在于基因的内含子区（intronic regions）以及基因的外显子（exonic regions）和3′UTR区（图2-1）。目前研究表明，大约有80%的miRNAs存在于编码蛋白质基因内含子区，其转录方向与内含子的转录方向一致，与宿主蛋白基因共转录，然后再从内含子中剪切分离出来。通常情况下，存在于编码蛋白质基因间隔区的miRNAs基因会远离蛋白质基因，具备自主的转录机制，可以进行独立的转录。此外，miRNA基因既可以以单个的形式存在于基因间隔区、基因内含子区以及长非蛋白编码区，也可以以基因簇的形式存在，即多个（通常是1～6个）miRNA通过一个共同的启动子转录成为多顺反子加工而来。比如： miR-17、 miR-91、 miR-18、 miR-19、 miR-19b、 miR-20和 miR-92这7个miRNAs就同属一个基因簇。它们由同一个启动子转录生成（图2-2）。这些以不同形式存在的miRNAs生物学意义是什么，现在还不得而知。

miRNA的生物合成与其在基因组中的位置有一定的关系，但其基本过程是相似的。2004年，Kim VN的研究团队采用选择性人RNA多聚酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，PolⅡ）抑制剂α-amanitin干预的方法首次证明PolⅡ在miRNA的生物合成中发挥重要作用 ^［1］，奠定了PolⅡ在miRNA转录中的地位。现在认为，miRNA生物合成过程的第一步是在PolⅡ的作用下从基因组中产生一个初始产物叫初级转录物（primary miRNA transcripts，pri-miRNA）。一个完整的pri-miRNA含有一个茎环发夹结构和两端编码miRNA序列的长臂，在长臂的5′端含有一个帽子结构（7MGpppG cap），3′端有一个多聚赖氨酸的尾巴（poly A tail）。这种注：位于染色体位置Chr21q21.3的 miR-155基因经转录后，以单顺反子的形式存在于hAT1R转录本的第三位外显子上； miR-221/222（ miR-221， miR-222）基因位于基因间隔区Xp11.3，经同一启动子的转录后，形成二顺反子； miR-17-92（ miR-17， miR-18a， miR-19a， miR-20a， miR-19b-1， miR-92-1）基因簇位于染色体位置Chr13q31.3，经同一启动子转录后，形成多顺反子。该多顺反子位于C13orf25转录本的第三位内含子上5′端加帽，3′端加尾的结构特征是PolⅡ转录编码蛋白质mRNA的共有结构（图2-3）。然而，2006年，Davidson BL团队在对人19号染色体进行miRNAs基因组分析时发现，人基因组中最大的miRNA簇：人19号染色体miRNA簇（human chromosome 19 miRNA cluster，C19MC）都是分散在Alu重复序列之间 ^［2］。通常情况下Alu的转录是通过募集RNA多聚酶Ⅲ（RNA polymeraseⅢ，PolⅢ）来实现的。随后，该研究团队进一步发现C19MC miRNAs上游的Alu元件含有招募和维持PolⅢ活性的重复序列，这个重复序列足以完成转录过程，首次提出PolⅢ可能参与了miRNA转录水平的调控过程。遗憾的是该团队没有进行生物学实验来进行验证。2009年，来自法国的一个研究团队在细胞水平证明C19MC miRNA簇的转录是由PolⅡ而不是PolⅢ调控的。至此多数研究者认为，由于PolⅡ是目前发现的唯一一个转录所有mRNA前体的RNA聚合酶，因此是调节内含子区miRNAs转录过程的主要的聚合酶 ^［3］。然而，存在于编码蛋白质基因间隔区的miRNA的转录过程是否都由PolⅡ负责？PolⅢ又是否真的能够控制miRNA的转录过程？如果PolⅢ不能够调节C19MC miRNA簇的转录过程，存在于染色体上众多的可以结合PolⅢ的Alu重复序列的意义是什么？人们对此还知之甚少，这些问题仍需更多的研究进行阐释。

尽管我们知道PolⅡ在miRNA合成的转录水平中发挥重要作用，但我们也知道PolⅡ与启动子区的结合力很弱，需要一些蛋白质的辅助才能够形成有活性的转录复合物。这些蛋白质称为转录因子（transcription factor，TF）。其中有些转录因子如：TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE和TFⅡF是所有PolⅡ启动转录都需要的转录因子，称为通用转录因子（general transcription factor）。正如特定的mRNA的转录生成还需要特定的转录因子的参与一样，每一种特定miRNA的转录调节也同样需要特异转录因子（special transcription factor）参与。特异转录因子通过与相应的增强子结合激活某种特异的miRNA的转录，决定miRNA的时空特异性表达。如：c-myc可以促进位于人13号染色体的6个miRNAs簇的表达 ^［4］；NF-κB可以调节 miR-195、 miR-100、 miR-146a和 miR-150的表达等 ^［5，6］。

在细胞核内转录生成的pri-miRNA在核糖核酸酶Ⅲ Drosha（RNaseⅢ enzyme）和DGCR8蛋白（DiGeorge critical region 8）所形成的核内微处理器复合体（Drosha-DGCR8复合体）的作用下被切割成具有70～100个碱基长度的前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）。通常情况下，人的pri-miRNA含有一个33个碱基对的发夹结构的茎区（hairpin stem），末端的环形区（terminal loop）和发夹结构上、下游的两个单链的侧翼区（flanking regions）。Pri-miRNA双链的茎区和两个单链的侧翼区是Drosha和DGCR8发挥作用的位点（见图2-3）。DGCR8蛋白上有2个双链RNA结合的区域，此区域可与pri-miRNA结合并精确地识别裂解位点 ^［7］。DGCR8蛋白羧基末端可与Drosha蛋白的中间区域结合，维持Drosha蛋白的稳定性。在此基础上，Drosha蛋白上的两个RNase区域分别在pri-miRNA茎区的3′和5′端裂解掉11个碱基对，从而形成pre-miRNA。pre-miRNA由一个拥有22个碱基对的发夹结构的茎区、末端的环形区和3′端突出的2～4个保守的核苷酸序列组成 ^［8-10］（见图2-3）。有趣的是，Drosha蛋白也可以与DGCR8 mRNA 5′端的两个发夹结构和编码区结合使后者降解 ^［11］。Drosha和DGCR8蛋白之间的这种相互关系提示这两种蛋白可通过负反馈调节方式来调节pri-miRNA向pre-miRNA转换的程度，从而维持miRNA生物合成达成一个稳态水平。值得一提的是，Drosha所介导的由pri-miRNA加工成为pre-miRNA的过程与多种因素有关，如miRNA自身的单核苷酸多态性及其二级结构的变化 ^{［12，13］}。由Drosha-DGCR8复合体介导的pri-miRNA加工过程有时还需要其他蛋白的参与（图2-4），如研究发现 pri-miR-18a的加工过程需要一种不均一核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNP A1）的存在才能够完成 ^［14］。 pri-miR-21的加工过程则更为复杂，是一个级联反应过程。首先，转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）和骨成型蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）表达升高，募集配体特异的信号转导蛋白SMAD，并与RNA解旋酶DDX5（p68）结合，从而形成SMAD/p68复合体。此复合体激活Drosha-DGCR8复合体，并配合Drosha和DGCR8完成对 pri-miR-21的加工过程 ^［15］。然而，pri-miRNA的加工并不是Drosha-DGCR8复合体专属过程。来源于内含子的pri-miRNA有可能就会绕过Drosha-DGCR8的作用直接形成pre-miRNA，前提条件是这个内含子必须含有具有剪接功能的套索支链淀粉酶（这样的内含子称为mirtron），同时，这个primiRNA含有套索支链淀粉酶的作用位点，从而具备形成一个pre-miRNA的发夹结构。这种miRNA被称为“mirtrons” ^［8］（图2-4）。

在细胞核内生成的pre-miRNA需要转运到细胞质内才能够发挥基因调控作用。这一转运过程是由一种叫exportin-5的转运蛋白来完成的。exportin-5识别pre-miRNA后进一步与核RanGTP结合形成premiRNA/exportin-5/RanGTP复合体，并将pre-miRNA转运到细胞质（见图2-3）。exportin-5是否能够识别并与pre-miRNA结合取决于pre-miRNA茎部的双链结构的长度（﹥16bp）和3′端突出的2～4个保守的核苷酸，而与pre-miRNA的序列和茎环的结构无关。此外，exportin-5不仅具有转运pre-miRNA的作用，同时还可以保护pre-miRNA在细胞核内不被核酸内切酶降解 ^{［16，17］}。进入细胞质的pre-miRNA/exportin-5/RanGTP复合体中的GTP被水解生成GDP，pre-miRNA便从复合体上解离下来 ^［18］。游离的pre-miRNA在RNaseⅢ Dicer的作用下，其环状结构被剪切掉生成长度为20～25个核苷酸的双链miRNA：miRNA ^*分子（dsmiRNA）。在这个过程中，伴侣分子TRBP（TAR RNA binding protein）起到稳定Dicer酶的作用，保证剪切过程的顺利完成 ^［19］。随后，胞质内的双链RNA在多种RNA解旋酶［p68、p72、RNA helicase A（RHA）、RCK/p54、TNRC6B、Gemin3/4］的作用下解螺旋并在AGO2蛋白的作用下，形成成熟的miRNA分子（图2-3）。

目前研究认为，每一种特定的dsmiRNA的解旋过程都由其特定的解旋酶解旋。但是，每一种特定的解旋酶如何选择其靶dsmiRNA，其内在规律如何？目前还不清楚。理论上，dsmiRNA与siRNA一样，解旋后的双链RNA可以生成两条成熟的miRNAs，但只有一条链是可以与miRNA诱导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complex，miRISC）结合并识别靶基因发挥作用。在dsmiRNA的解旋过程中，AGO2通过与Dicer酶末端结合将dsmiRNA解旋后生成成熟的miRNA的互补链miRNA ^*移走 ^［20］。miRNA ^*在细胞质内不稳定，会很快被降解，因此一直以来被认为是合成成熟miRNA的副产品。然而，随着研究的不断深入，人们发现miRNA ^*在有些组织内的表达甚至高于成熟的miRNA，并且也可以调节基因的转录过程 ^［21］。此外，有些miRNAs，比如 miR-451和 miR-735的成熟过程越过了Dicer酶调节miRNA成熟的路径，而是直接将裂解的3′末端与AGO2的催化中心结合形成成熟的 miR-451和 miR-735。目前对于这种现象的解释是 pre-miR-451/735的序列十分短，只有17个核苷酸的茎部区域，使之很难去识别并结合Dicer酶。这一现象提示pre-miRNAs的结构的不同可能会使得miRNAs成熟的途径不同。这些研究进一步开阔了人们对基因调控网络的认识。

通常情况下，AGO蛋白与Dicer酶解离后，TNRC6（trinucleotide-repeat-containing-gene-6）就与AGO结合。TNRC6在调节RISC活性方面发挥重要作用并被认为是AGO2结合平台的标志性蛋白。研究发现，TNRC6通过WG/GW基序直接与AGO2结合，可能在募集miRNA靶mRNA进入RISC复合体、影响mRNA脱腺苷和脱帽中发挥作用。一旦TNRC6的C-末端从AGO蛋白上解除，可以导致miRISC（AGO、miRNA、靶mRNA和TNRC6）的聚集，但是miRNA的活性却下降了。在这个复合体上，poly-A结合蛋白（PABP）首先从复合体上解离，暴露靶mRNA的5′帽和3′poly-A，为mRNA进一步的脱帽和去腺苷做好准备。随后，复合体进入P小体。P小体内富含RNA脱帽和脱腺苷的蛋白质，是哺乳动物mRNA降解的主要场所。在P小体内miRNAs发挥完其抑制或降解mRNA的作用后，mRNA便离开RISC，并开始形成新的RISC复合体。

与编码蛋白质的mRNA一样，pri-miRNA也可以发生RNA的修饰。这一过程是由腺苷脱氨酶（adenosine deaminases acting on RNAs，ADARs）将腺嘌呤（A）脱氨基变成肌苷（I）。由于腺嘌呤碱基配对的特性与鸟嘌呤（guanosine，G）相似，pri-miRNA序列中由A变成I的修饰不仅可以改变转录本的序列、碱基配对和空间结构特征，而且可以影响其后续加工过程和识别靶基因的能力。研究发现ADAR1和ADAR2可以修饰 miR-22、 miR-151、 miR-197、 miR-223、 miR-376a、 miR-379、 miR-99a、 miR-142、 miR-223、 miR-1-1和 miR-143 ^［22-24］。但是尽管ADAR介导的pri-miRNA的修饰都是将A变成I，其所产生的效应却是不同的。比如，对于 pri-miR-142来说，A变成I的修饰抑制了Drosha酶将 pri-miR-142转变成 pre-miR-142的裂解作用，并促进了核糖核酸酶Tudor-SN对 pri-miR-142的降解作用，并最终使成熟的 miR-142生成减少 ^［24］。对于 primiR-151来说，这种修饰不影响Drosha酶的裂解作用但却阻止了Dicer酶对双链miRNA：miRNA ^*分子（dsRNA）的裂解和转移作用。此外，研究发现 pri-miR-376的A变成I的修饰改变了成熟 miR-376识别其新的靶基因的能力，改变了其对靶基因的转录后调控作用。现在的问题是，miRNA的这种修饰是否只发生在核内或细胞质内，A变成I的修饰是否只发生在pri-miRNA的水平，在pre-miRNA和成熟的miRNA水平是否也会发生这样的修饰目前还不清楚。