应激相关障碍的发生，理论上都要通过应激所引发的中枢神经系统反应性病理生理改变，才有可能最终导致精神或躯体疾病。由于PTSD致病因素特殊，涉及面广，影响因素多，个体差异大；同时，限于精神与心理疾病临床研究的特殊性，目前很难确定这些可能存在的CNS应激反应性机制的具体部位和作用方式，而且，对于PTSD而言，或许不可能是CNS某一单一的作用环节和机制，而更可能涉及多种重要作用途径并存，且相互制约、相互交汇作用，但在这些关键的通路上寻找一些关键作用环节，并深入阐明这些问题的相关机制，对进一步揭示PTSD发病机制、探寻有效干预手段有重要意义。

虽然近二十年来有关PTSD神经生物学方面取得了许多令人振奋的进展，但相关机制目前仍不明确，特别是如下一些疑问仍亟待进一步探讨、揭示和认知：①短暂严重的心理/生理应激如何引发持续性精神行为异常？②这种持续性PTSD样精神行为异常是否存在CNS中相对特异或某些关键部位的神经可塑性改变和细胞顺应性异常？③这些CNS应激反应性持续性神经生物学改变的主要作用环节可能是什么？进一步揭示这些应激障碍相关CNS应激反应性机制或可有助于深入认识PTSD相关神经生物学机制。

为此，近十余年来，我们在国家自然科学基金、军队“九五”、“十五”、“十一五”及“十二五”科研基金资助下，先后对非颅脑严重生理创伤对CNS的可能影响、严重生理/心理应激所致PTSD样行为异常动物模型建立及相关神经生物学机制进行了系列探讨；特别是围绕应激相关CNS反应性易损区，以及在海马神经元兴奋性异常、突触可塑性改变和神经元功能受损中有重要作用的相关机制，重点探讨了这些神经生物学物质基础在实验大鼠PTSD样行为异常中的变化特点和可能作用，为深入认识PTSD发病机制提供实验依据，为进一步开辟治疗手段提供新思路。

通过采用非颅脑直接伤的犬双后肢不同应激强度的火器伤模型揭示，除HPA轴相关的激素及受体，包括CRF、ACTH、糖皮质激素、儿茶酚胺类神经递等水平明显增高外，远离致伤部位的脑组织，以及脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）和血浆内皮素1（endothelin 1，ET1）、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）含量及ET1-mRNA、MBP-mRNA表达亦明显增高，且与创伤应激强度密切相关，特别是CNS边缘系统下丘脑、海马等处脑组织增高更为明显。同时，CNS超微结构出现相应改变，且仍以下丘脑、海马结构为主，主要表现为神经细胞核电子密度降低，核膜皱缩，核染色质块状边聚；胞质细胞器减少，线粒体空泡变性、嵴断裂；毛细血管内皮细胞肿胀；髓鞘变性、脱失；胶质细胞水肿等；其他脑区仅见轻微或未见明显类似改变。显示远离大脑的局部肢体严重致伤后应激障碍早期，虽然并未直接伤及大脑，但机体及CNS不仅存在与所施应激强度相应的神经内分泌异常，还同时存在一定程度的神经病理学改变，且这些改变主要表现为下丘脑和海马结构的不同程度、不同范围受损，提示此二脑区是CNS应激应答敏感区，并可能为创伤应激反应性CNS易损区。

下丘脑（hypothalamus）是自主神经系统（autonormic nervous system）与内脏活动的皮质下高级中枢，在大脑皮质的调节下，调节延髓和脊髓内的低级中枢，控制交感和副交感神经的活动，维持机体内环境稳定，保持机体与外环境的平衡，参与了机体的许多生理过程，特别是调节体温与水电解质平衡、情感反应和睡眠调控等。因此，下丘脑受损可导致一系列生理功能的障碍，特别是神经内分泌失调、内环境紊乱和情绪反应异常。

海马结构（hippocampal formation）属嗅脑，是边缘系统（limbic system）的重要组成部分。神经冲动从内嗅区（entorhinal region）传至海马，途中与新皮层及其周围的海马结构形成广泛的纤维联系；而CA1区神经元的传出纤维经海马槽（alveus）至穹隆（fornix），最后大部分纤维分布于隔区（septal area）与下托复合体（subiculum complex）；其中，海马结构与丘脑前核（anterior thalamic nuclei）、板内核群（interlaminar nuclei）、下丘脑、乳头丘脑束（mammillothalamic tract）、扣带回（cingulate gyrus）等组成的环路在情绪反应与情感行为调节、学习和记忆能力调控中有重要作用，与精神、情绪、记忆、行为及其某些内脏等活动密切相关。

因此，下丘脑、海马结构选择性受损势必引发或加重神经内分泌紊乱，情感行为异常，以及学习和记忆能力受损，这为进一步认知应激性中枢神经受损提供了新思路，对进一步认识PTSD相关CNS应激反应机制可能有重要意义。

既然严重生理应激可引发CNS下丘脑、海马结构为主的选择性受损，那么通过电刺激直接改变海马神经兴奋性是否可引发实验动物PTSD样行为改变？

海马或杏仁核（amygdala）电点燃（kindling）可诱发大鼠持续性情感行为改变，因而亦被用作模拟PTSD患者焦虑障碍方面的研究；但是，由于实验动物常同时伴有部分性惊厥行为表现而很难排除惊厥适应性反应等影响因素，因此，我们通过可基本排除惊厥适应性反应影响的海马惊厥阈下电刺激，直接引发海马神经兴奋性改变，成功诱发了实验大鼠持续较长时间的活动习性改变、惊恐反应增强、旷场活动性减少、拒俘反应性增强、探究行为减少，以及一定时间内空间学习和记忆能力受损等多种PTSD样行为异常表现，显示海马神经兴奋性异常在PTSD发生发展中有重要意义。

上述研究揭示通过电刺激诱发海马结构神经元兴奋性改变可导致实验动物PTSD样行为异常，那么不同诱因所致实验动物PTSD样行为异常时是否存在与海马神经元兴奋性相关的CNS神经生物学改变？

为此，我们首先通过惊厥阈下电刺激及捕食行为所致严重心理创伤应激（捕食应激，predator stress），建立了两种不同原因诱发、可对比观测、且均可基本模拟PTSD患者多种临床表现的动物实验模型，并在此基础上，重点探讨了PTSD样行为异常大鼠相关CNS神经生物学改变。研究结果显示，二者均可引发一定时效的、与实验大鼠情感行为异常及空间学习和记忆能力受损的严重程度基本同步的、以海马结构为主的细胞内Ca ²⁺超载，Na ⁺-K ⁺-ATP酶与Ca ²⁺-ATP酶活性降低、一氧化氮（nitric oxide，NO）释放增多与神经元型NO合酶（neuronal NO synthase，nNOS）表达增强、Ca ²⁺/CaM依赖性蛋白激酶途径调控紊乱，以及持续性低皮质酮反应和GR-MR表达异常等一系列神经生物学改变。

ATP酶是生物膜上的一种蛋白酶，在物质运输、能量转换及信息传递等方面具有重要作用。其中，脑组织Na ⁺-K ⁺-ATP酶（钠钾泵）及Ca ²⁺-ATP酶（钙泵）可通过水解ATP逆电化学梯度进行离子转运，是维持神经元兴奋性、冲动传导、突触传递、胞内离子内环境稳定的重要物质基础。线粒体则是细胞内一种重要的细胞器，其主要功能是通过质膜上电子传递链（electron transport chain，ETC）的氧化磷酸化作用合成细胞代谢所需的大量ATP；越来越多的研究显示，线粒体在神经细胞兴奋性调节、细胞内环境稳定、重要物质和能量代谢调控、细胞分化（cell differentiation）与凋亡（apoptosis）等CNS多种生理、病理效应中有重要作用。因此，当PTSD样行为异常大鼠海马细胞钙超载（Ca ²⁺ overload）时，即可能通过引发线粒体离子泵功能受损，促使其氧化磷酸化电子传递脱耦联，导致ATP合成障碍，由此可能进一步引发或加重神经细胞内Na ⁺、Ca ²⁺等离子大量聚积，K ⁺离子外流，胞内离子内环境紊乱，形成恶性循环，最终可能导致海马神经元兴奋性改变和功能异常。

同时，细胞内Ca ²⁺持续增高还可通过与Ca ²⁺结合蛋白（Ca ²⁺-binding proteins）结合导致神经毒性作用，并在突触后兴奋性传递、Ca ²⁺内流诱发的突触活动性改变以及活动依赖性神经元基因调控（activity-dependent neuronal gene regulation）中亦有重要意义。而对作为CNS中最主要的一种Ca ²⁺结合蛋白——钙调素（calmodulin，CaM）的检测发现，实验动物海马总CaM表达明显增高，而细胞内游离CaM含量则显著降低，提示海马细胞内与Ca ²⁺结合的CaM含量变化与细胞内Ca ²⁺改变基本同步。游离CaM的EF手结构使其本身并不具有生物活性，但当Ca ²⁺与其开环顺序中的Ca ²⁺结合位点（Ca ²⁺binding site）结合时，可改变CaM的空间构象（conformation），形成Ca ²⁺-CaM复合体（Ca ²⁺-CaM complex），从而可与细胞内多种CaM结合蛋白相互作用，以调节细胞内多种Ca ²⁺依赖性激酶、钙调磷酸酶（calcineurin）及Ca ²⁺-ATP酶活性，同时还可产生具有细胞毒性作用的NO，导致CNS功能紊乱。

NO由NOS作用于L-精氨酸（L-arginine）的胍基氮产生，真核细胞NOS以双聚体形式作为活性单位，其中，诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）在合成时已结合了CaM，而nNOS与内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）的激活则依赖于外源性Ca ²⁺/CaM。因此，当PTSD样行为异常大鼠海马细胞内Ca ²⁺-CaM复合体增多时，即可能通过激活NOS而引发NO释放增多。同时，实验大鼠额叶皮层NO含量仅于电刺激停止后24小时内增多，而海马的增高可持续至72小时，并于24小时增至顶峰，显示惊厥阈下电刺激所致PTSD样行为异常大鼠存在以海马结构为主的NO持续过量释放。进一步对脑组织NO合酶及其亚型nNOS的检测发现，代表nNOS、iNOS和eNOS活性总和的NOS在电刺激停止后24小时内明显增高，但72小时时已恢复至正常水平，与NO含量变化并不同步；而nNOS表达却呈现了与NO相同的变化趋势：阈下刺激组大鼠海马的增高可持续至电刺激停止后72小时，而额叶皮层并无明显改变，提示实验大鼠海马nNOS异常表达，可能是NO长时间释放增多的主要原因。

研究表明，增多的NO主要通过其还原型亚硝酸离子（NO ^-）与超氧阴离子（O ₂ ^·-）反应形成过氧化亚硝酸（peroxynitrite）阴离子（ONOO ^-），从而抑制腺苷酸环化酶（adenylate cyclase）、蛋白激酶C（protein kinase C）及核糖核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase）活性，并可破坏DNA结构，损伤脂质膜，干扰CNS正常的物质和能量代谢、信息传递及细胞内稳态的维持，导致神经毒性作用。同时增高的NO还可通过突触LTP诱导障碍、神经递质释放与再摄取异常、NO-Ras信号转导途径（signal transduction pathway）失调等，导致由NO参与的神经元活动依赖性核基因调控与海马长时程突触可塑性异常，进而影响动物的情感行为、学习和记忆等认知功能；而增多的NO亦可促使Ca ²⁺进一步过量释放，形成恶性循环。同时，nNOS在突触可塑性与神经再生、神经传导与神经元发育、神经内分泌调节与行为调控中也有非常重要的作用，而持续增高的nNOS本身亦可直接影响实验大鼠行为及认知功能。因此，实验动物海马细胞钙超载所致nNOS持续性高表达与NO释放明显增多，在惊厥阈下电刺激所致大鼠PTSD样行为异常中可能有重要意义。

作为CNS中最重要的一种CaM结合蛋白，Ca ²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca ²⁺/CaM dependent kinase Ⅱ，CaMKⅡ）在脑组织中分布广泛，占脑组织总蛋白量的0.25%~2%，其中以海马中的含量最高，占其总蛋白量的1%~2%；同时还是突触后致密体（postsynaptic density）的主要组成成分，占其蛋白总量的20%~30%，与突触小泡（synaptic vesicle）的功能及LTP形成密切相关。对PTSD样行为异常大鼠脑组织中含量最多的一种CaMKⅡ异构体——CaMKⅡα的检测显示，与Ca ²⁺-CaM变化趋势相反，实验动物海马CaMKⅡα表达明显降低，提示CaMKⅡα表达与海马神经元兴奋性间可能存在负相关。有研究发现，Ca ²⁺-CaM-CaMKⅡα信号途径对维持神经细胞内cAMP/cGMP平衡有重要作用。当CaM表达增高、CaMKⅡα活性下降时可促进磷酸二酯酶（phosphodiesterase）活性增强，引发cAMP/cGMP失衡，促使神经元兴奋与抑制过程紊乱，导致海马细胞功能受损。同时，CaMKⅡα还是LTP产生的一个重要分子基础，突触后注射CaMKⅡα抑制剂以减少其表达可阻断LTP的产生，而增加海马CA1区CaMKⅡα活性则可促进突触传递及LTP产生。因此，PTSD样行为异常动物海马CaMKⅡα下调，可能通过引发海马神经元兴奋性改变而参与了实验动物较长时间情感行为异常与短期空间学习和记忆能力受损。

作为CNS另一种主要的CaM结合蛋白，Ca ²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅳ（CaMKⅣ）只存在于脑组织、T淋巴细胞及减数分裂后的雄性生殖细胞，在核基因转录调控中有重要意义。但与CaMKⅡα不同，CaMKⅣ激活的前提是与Ca ²⁺/CaM结合，并在Ca ²⁺/CaM依赖性蛋白激酶K（CaMKK）作用下完成其活化环中单个苏氨酸残基磷酸化及N末端丝氨酸残基自身磷酸化作用。因此，当PTSD样行为异常大鼠海马Ca ²⁺/CaM增高时即可活化CaMKⅣ，从而可能通过促磷酸化作用激活CREB而进一步调节Ca ²⁺介导的活动依赖性核基因表达；还可能通过促使突触蛋白Ⅰ（synapsin Ⅰ）和NFκB（nuclear factor-κB）磷酸化，并与蛋白激酶A、蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等相互交汇作用，在神经元LTP形成及长时程学习记忆中有至关重要的作用。因此，实验动物海马CaMKⅣ表达明显增高，在惊厥阈下电刺激所致PTSD样行为异常大鼠短期学习记忆障碍等认知功能受损中可能有重要意义。

有趣的是，在与PTSD有相似的致病因素与发展过程的捕食应激PTSD模型基础上，进一步对实验大鼠脑组织Ca ²⁺及钙依赖性反应的研究发现，捕食行为所致严重心理应激亦可引发与惊厥阈下电刺激模型相似的、一定时效的、以海马结构为主的细胞内钙超载、NO释放增多与nNOS表达增强、Ca ²⁺/CaM依赖性蛋白激酶途径调控紊乱。其具体原因尚不清楚，但鉴于上述神经生物学改变在突触可塑性与神经再生、神经冲动传导与突触传递、学习和记忆调节与情绪反应调控中的重要作用，结合本实验两种不同模型所引发的基本相似的神经生物学效应，进一步表明短暂急性应激所致这些一定时效的在海马神经元兴奋性异常、突触可塑性改变及神经元功能受损中有重要作用的Ca ²⁺及钙依赖性反应紊乱，在捕食应激所致实验大鼠PTSD样行为异常中可能有重要意义，值得进一步深入探讨。

值得注意的是，捕食应激后实验大鼠海马CaMKⅡα表达较对照组明显增高，与惊厥阈下电刺激所致PTSD样行为异常大鼠的CaMKⅡα表达降低似不一致，考虑可能与所采用的动物模型不同有关：海马惊厥阈下电刺激模型引发的CaMKⅡα降低可能与阈下电刺激可直接引发海马神经元兴奋与抑制过程紊乱有关。但具体原因和意义仍待进一步确定。

外界刺激既可引发细胞某些蛋白或酶活性的改变而产生一些瞬间效应，也可通过调节核转录因子（transcription factors）磷酸化，激活细胞内蛋白激酶级联反应（protein kinase cascade），诱导靶细胞基因表达而引发长时程效应。cAMP依赖性反应元件结合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）是其中最具代表性的一种核转录因子。近年研究发现，cAMP依赖的蛋白激酶A（cAMP dependent protein kinase A，PKA），以及Ca ²⁺信号通路（calcium signaling pathway）特别是Ca ²⁺/CaM依赖性蛋白激酶途径均可促使CREB的特定丝氨酸残基Ser-133磷酸化而激活CREB形成磷酸化CREB（phosphorylated CREB，pCREB），从而可与靶基因上特定的DNA序列即CREB结合位点（CREB binding sits）结合，并进一步与CREB结合蛋白（CREB binding protein，CBP）形成特异性CREB-CBP复合体（CREB-CBP complex），从而可与基础转录因子（basal transcription factors）——转录因子ⅡB（transcription factor ⅡB，TFⅡB）作用，并可同时吸引RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ）启动因子，进而激活相关转录途径而介导一系列长时程活动依赖性核基因表达。

研究显示，捕食应激后早期应激大鼠海马细胞核转录因子CREB明显下调，而其磷酸化的活化形式pCREB则短期显著增高，CBP也同步明显增多；免疫组织化学研究进一步揭示，捕食应激大鼠不同部位脑组织均存在上述异常表达，且以海马结构的改变更明显，表明捕食行为所致严重心理应激在引发一定时效的、与实验大鼠情感行为异常及空间学习和记忆能力受损的严重程度基本同步的、以海马结构为主的细胞内Ca ²⁺超载及钙依赖性反应紊乱的同时，还激活了实验大鼠脑组织CREB介导的核转录途径（CREB-mediated transcription），从而可能诱发更长时程的生物学效应。

CREB转录调控途径在CNS的多种神经递质与脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）诱导的基因表达中有重要意义，并在神经可塑性改变与细胞顺应性（cellular resilience）调节、突触LTP诱导与学习和记忆形成中亦有至关重要的作用；同时，CREB还是即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）的转录因子 ^［83］；且CRF基因启动子（promoter）上也有CREB结合位点，而GR与MR通过调节细胞内Ca ²⁺浓度又可影响CREB磷酸化-脱磷酸化（phosphorylation and dephosphorylation）过程，显示CNS应激反应调控与CREB间也存在某些联系。因此，同时还激活了实验大鼠中枢神经细胞介导的核转录途径，从而可能诱发更长时程的生物学效应。推测捕食应激后CREB转录途径的激活在短暂严重心理应激所致长时程行为异常与短期空间学习和记忆等认知功能受损中可能有重要意义。

有趣的是，抑郁症（depression）患者颞叶（包括海马）CREB水平明显降低，而抗抑郁治疗后则显著升高，显示CREB可能与抑郁症的发病机制密切相关。而我们实验中虽然也有类似发现，但作为CREB活化形式的pCREB，以及只与pCREB特异结合才可启动转录调控机制的CBP却同时增高，推测这种同一转录途径上所表现的不同反应性，可能与所检测的不同内容、不同CNS部位，以及所涉及的不同病种和模型有关，但这些神经生物学改变在PTSD样行为异常发病中的具体作用仍待进一步探讨。

同时，CaMKⅣ可通过促使CREB磷酸化，促进大量结构正常、有NMDA受体表达但缺乏α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸（alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）受体表达的沉默突触（silent synapses）的形成。沉默突触是指在神经环路中具有能够传递信息的结构，但并没有生理功能的不成熟突触。突触前神经元谷氨酸等神经递质异常释放等突触前膜基本的分子结构异常，与突触后膜只表达NMDA受体而缺乏AMPA受体等突触后膜受体的异常，均可影响突触的信号传递功能，导致其功能沉默。沉默突触在适宜的刺激下可活化为功能性突触，而功能性突触也可在一定条件下重新转变为沉默突触；这种转化过程是突触成熟与神经系统发育、长时程增强与学习记忆形成、突触可塑性调节与神经环路重塑的重要物质基础。近年的研究还揭示，海马神经发生异常在抑郁症等情感行为障碍中也有重要作用，神经生长因子与NMDA受体拮抗剂等调节突触传递功能可减轻抑郁症的临床症状。

中枢神经系统棘突触后膜的兴奋性氨基酸受体—NMDA受体和AMPA受体是发生突触传递效能可塑性的主要靶位，AMPA受体在棘突触后膜上数量的改变和AMPA受体转运（AMPA receptor trafficking）是造成突触可塑性改变的重要因素。而CaMKIV可通过促使CREB磷酸化，引发棘突触后膜AMPA受体转运，导致大量有NMDA受体存在但缺乏AMPA受体表达、结构正常但没有传递功能的沉默突触（silent synapses）形成；而这种转化过程与突触传递效能改变正是突触成熟与神经系统发育、长时程增强与学习记忆形成、突触可塑性调节与神经环路重塑的重要物质基础。

因此，结合我们的前期研究，有理由推测：短暂严重心理/生理应激→选择性作用于海马、杏仁核等边缘区细胞→引发一定时限的神经细胞内Ca ²⁺和（或）cAMP依赖的蛋白激酶系统紊乱→激活以CREB为主的核转录因子→启动相关基因组较长时间反应→促进细胞内蛋白激酶级联反应及c-fos等IEGs表达→促使突触后膜AMPA受体数量改变和异常转运，损害了活性依赖性突触传递功能→引发海马沉默突触转化与树突棘结构重塑→引发一定时程的细胞顺应性改变，使机体处于某种病理性“待激”状态→重复相关刺激（如接触与初次应激相关的刺激）→诱发、加深这种病理性状态→启动、强化上述级联效应→最终导致PTSD样迟发性、持续性精神与行为异常。进一步揭示并验证上述假设，将有助于深入认识PTSD相关神经生物学机制，并为探讨有效治疗途径提供新思路。