实验11　薄层色谱分离偶氮苯和邻硝基苯胺（Separation of Azobenzene andortho-Nitroaniline by Thin Layer Chromatography）

【实验目的】

（1）了解薄层色谱的基本原理及其用途；

（2）熟练掌握薄层色谱的操作方法。

【实验原理】

本实验是以CMC-硅胶薄层板鉴定偶氮苯和邻硝基苯胺，具体原理见2.8.1。

【试剂及仪器】

试剂：硅胶G，1％的羧甲基纤维素纳（CMC）水溶液；1％偶氮苯的1，2-二氯乙烷溶液，1％邻硝基苯胺的1，2-二氯乙烷溶液，1％偶氮苯的1，2-二氯乙烷溶液和1％邻硝基苯胺的1，2-二氯乙烷溶液的等体积混合液，1，2-二氯乙烷与环己烷的等体积混合液。

仪器：小型色谱缸一个，载玻片（2.5cm×7.5cm）5块，烘箱，直尺，毛细管。

【基本操作预习】

薄层色谱（http://202.118.167.67/jpkdata/video/yjhx22/yjhxsy/sepufa-3.htm）

【实验步骤】

（1）制备薄层板（1）　取2.5cm×7.5cm左右的载玻片5块，洗净晾干。在50mL烧杯中，放置3g硅胶G，逐渐加入1％的羧甲基纤维素纳（CMC）（2）水溶液8mL，调成均匀的糊状。然后采用倾注法铺板，将糊状物小心倾倒于上述洁净的载玻片上，制成薄厚均匀、表面光洁平整的薄层板。涂好硅胶G的薄层板置于水平的台面上，使其晾干（3）。

将晾干后的薄层板放入烘箱中，缓慢升温至110℃，活化半小时，取出，稍冷后置于干燥器中备用。

（2）点样（4）　取2块用上述方法制好的薄层板，分别在距薄层板一端约1cm处用铅笔画一水平横线作为起始线。用管口平整的毛细管在起始线上点样，每块板上点两个样点，一块板上点1％偶氮苯的1，2-二氯乙烷溶液和混合溶液两个样点，在另一块板上点1％邻硝基苯胺的1，2-二氯乙烷溶液和混合溶液两个样点，样点直径均应小于2mm，间距至少1cm以上。如果溶液太稀，样点模糊，可待溶剂挥发后在原处重复点样，晾干或吹干。余下的3块薄层板，1块留作机动，另2块上分别点偶氮苯的1，2-二氯乙烷溶液（或1％邻硝基苯胺的1，2-二氯乙烷溶液）和一个未知样（偶氮苯或邻硝基苯胺）。

（3）展开（5）　在色谱缸中加入适量的1，2-二氯乙烷与环己烷的等体积混合液作为展开剂，待色谱缸被展开剂蒸气饱和后，将点好样的薄层板放入，使点样一端向下，展开剂不得浸及样点（见图2-37）。当展开剂前沿上升到距离薄板上端约1cm时取出，立即用铅笔标出前沿位置，依次展开其余各板。

（4）测量和计算　用直尺测量展开剂前沿及各样点中心到起始线的距离，计算各样点的Rf。

（5）比较分析　将已经展开好的几块薄层板并排平放在一起，比较分析由混合样点所分得的样点中哪一个是偶氮苯，哪一个是邻硝基苯胺，确定未知物，并从分子结构解释其Rf的相对大小。

【注意事项】

（1）薄层板的制备应注意两点：载玻片应干净且不被手污染，吸附剂在载玻片上应均匀平整。为此，宜将吸附剂调得稍稀些，尤其是制硅胶板时，否则，很难将吸附剂铺摊均匀。

（2）配制1％的CMC溶液：按照每克羧甲基纤维素钠100mL蒸馏水的比例在圆底烧瓶中配料，加入几粒沸石，装上回流冷凝管，加热回流至完全溶解，用布氏漏斗抽滤。也可在配料后用力摇匀，放置数日后直接使用。

（3）铺好的薄层板必须晾干，否则活化时将产生皲裂。

（4）点样用的毛细管必须专用，不得弄混。点样时，毛细管液面刚好接触到薄层即可，千万不能戳破薄层板面。

（5）展开时，不要让展开剂前沿上升高度超过载玻片顶端，否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。

【思考题】

（1）薄层色谱为什么可以用来分离物质？

（2）在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层板上的位置？

（3）为什么展开剂的液面要低于样点？如果液面高于样点会出现什么后果？

（4）制备薄层板时厚度对样品的展开有什么影响？

2.8.2　柱色谱（http://202.118.167.67/jpkdata/video/yjhx22/yjhxsy/sepufa-1.htm）

柱色谱（column chromatography）是在一根玻璃管或金属管中进行的色谱技术，将吸附剂或支持剂填充到管中，使之成为柱状，称为色谱柱。使用柱色谱可以分离大多数有机化合物，尤其适用于复杂的天然产物的分离。可以提纯和分离较大量的样品（几毫克到几百毫克）。

2.8.2.1　柱色谱原理

常用的有吸附柱色谱、分配柱色谱、离子交换色谱等。吸附柱色谱常用活性氧化铝和硅胶作固定相。在分配色谱中常以硅藻土和纤维素等作支持剂，以吸收较大容量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。在此重点介绍吸附柱色谱。

吸附柱色谱基本原理与吸附薄层色谱相同，也是基于各组分与吸附剂之间吸附强弱的差异，实现物质分离的目的。在吸附柱色谱中，固定相为吸附剂，流动相称为洗脱剂，相当于薄层色谱的展开剂。吸附柱色谱装置如图2-40所示。通常是在下端带有活塞的玻璃管（色谱柱）中填入表面积很大、经过活化的多孔性或粉末状固体吸附剂，从柱顶加入混合物样品溶液，各组分被吸附在柱的上端，然后连续加入洗脱剂，随着洗脱剂的向下流动，样品在吸附剂上反复地进行着吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程，吸附时则停顿，解吸时则随着洗脱剂向下移动。由于各组分对于吸附剂的作用能力不同，向下移动的速率也不同，作用能力强的向下移动得慢，作用能力弱的移动得快，分别收集各组分的洗脱液，再逐一鉴定。如各组分为有色物质，则在色谱柱上可以直接观察到不同颜色的谱带；如为无色物质，可用紫外光照射，有些物质呈现荧光。有时则可分段收集一定体积的洗脱液，通过薄层色谱逐一鉴定，相同组分的收集液合并，蒸出溶剂，即可得到单一的纯物质，使得各组分得到了分离。

（1）吸附剂　柱色谱用的吸附剂与薄层色谱类似，常用的吸附剂有Al2O3、硅胶、MgO、CaCO3、活性炭、聚酰胺等。

柱色谱中吸附剂颗粒一般比薄层色谱稍大，通常使用的Al2O3颗粒大小为100～150目，硅胶的颗粒大小为100～200目。粒度太小，比表面大，吸附能力强，但溶液的流速太慢，易使谱带扩散，分离效果不好；若颗粒大，则比表面小，吸附能力差，溶液的流速太快，分离效果差。供柱色谱使用的Al2O3有酸性、中性和碱性三种。

吸附剂与溶质之间吸附作用的强弱，基本遵循这样一个粗略的规律：极性吸附剂易于吸附极性溶质；非极性吸附剂易于吸附非极性溶质。如极性吸附剂Al2O3对于各类化合物的吸附能力随化合物极性的降低而下降，一般有如下的规律：

酸、碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯烃>饱和烃

（2）洗脱剂　在柱色谱分离中，洗脱剂的选择非常重要。通常根据被分离物质中各组分的极性、溶解度和吸附剂活性来考虑。

通常洗脱剂的选择可通过薄层色谱实验确定。在薄层色谱中能将样品中各组分完全分开的展开剂，就可作为柱色谱的洗脱剂。此外在选择洗脱剂时要注意以下两点：

①洗脱剂与吸附剂间的极性相近、作用力强，则吸附剂将优先吸附洗脱剂，对样品的吸附作用相对减弱，各组分流出较快，彼此难以分离；

②若洗脱剂与各组分的作用力强、对其溶解度太大，同样会使各组分快速流出；相反，则流出速率太慢，扩散作用使色带变宽，甚至发生重叠，也难以获得好的分离效果。

选择洗脱剂时一般要求以下几点：

①当使用极性吸附剂时，洗脱剂的极性要略低于样品的极性；当使用非极性吸附剂时，洗脱剂的极性要略高于样品的极性；

②洗脱剂对样品的溶解度要适当；

③洗脱剂与吸附剂不能发生化学反应；

④洗脱剂纯度要高，不含杂质。

色谱柱的洗脱首先使用极性较小的溶剂，然后逐渐增加洗脱剂的极性，使极性不同的化合物按极性大小由小到大的顺序自色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下顺序递增：

己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸

（3）被分离物质的结构　被分离物质各个组分的分子结构，对于正确选择吸附剂和洗脱剂是非常有益的。若待分离的组分极性较大，或含有极性较大的基团，应选用极性较弱的吸附剂和极性较大的洗脱剂。反之，对于极性较小的样品，则选用极性较强的吸附剂和弱极性或非极性的洗脱剂。若各组分极性差别很大，易于分离，可选用较为短粗的柱子，使用较少的吸附剂；若各组分极性相差很小，难以分离，则选用细长的柱子，并使用较大量的吸附剂。总之，待分离物质只要在结构上存在差异，其极性大小就会不同，就可能被分离。

（4）色谱柱的大小和吸附剂用量　吸附柱色谱的分离效果不仅依赖于吸附剂和洗脱剂的选择，而且与色谱柱大小和吸附剂用量有关。一般要求柱中的吸附剂用量为被分离样品量的30～40倍，若必要时可增至100～200倍；柱直径为其长度的1/10～1/4，实验室常用的色谱柱直径在0.5～10cm之间。

2.8.2.2　操作步骤

（1）装柱　将色谱柱洗净、干燥，底部铺一层玻璃棉或脱脂棉，再铺一层5mm厚的洗净干燥的石英砂（或用一张比内径略小的圆形滤纸），以保持平整的表面。有的色谱柱下端已是用砂芯片烧结而成，可直接装柱。常用的装柱方法有干装法和湿装法两种。

①干装法　干装法是将干吸附剂通过洗净、干燥的漏斗倒入柱内，不间断地形成一细流慢慢加入柱内，同时用洗耳球（或带橡皮塞的玻璃棒）轻轻敲打色谱柱，使填装均匀，再在上面加一层5mm厚的石英砂。柱装好后，打开下端活塞，从上端倒入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。

②湿装法　湿装法是先将洗脱剂倒入柱内约为柱高的1/2，然后将吸附剂连续不断地慢慢倒入柱内（或将适量的吸附剂与洗脱剂调成混悬液或糊状慢慢倒入柱内），同时将下端的活塞打开，使洗脱剂以每秒1滴的速率慢慢地流出，带动吸附剂缓慢沉于柱的下端，至吸附剂的沉降不再变动且洗脱剂液面微高于吸附剂表面为止，并使吸附剂的上表面平整，此时在吸附剂上面轻轻压上一小圆滤纸，以防在加入样品溶液和洗脱时将吸附剂冲起。

无论采用哪种方法装柱，都必须装填均匀，严格排除空气，否则将影响分离效果。一般来说，湿装法比干装法装得紧密均匀。

（2）加样　将适量样品以适量溶剂溶解。打开色谱柱的活塞，将顶部多余的溶剂放出，到柱内液面刚好接近吸附剂表面时关闭旋塞。用滴管小心地将样品溶液沿管壁均匀加到柱顶上。加完后用少量溶剂把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用溶剂洗涤柱壁上的样品。慢慢打开活塞，调整液面和吸附剂表面相齐时，即可用洗脱剂洗脱。

（3）洗脱　将选择好的洗脱剂放在滴液漏斗中，打开活塞，连续不断地慢慢滴加在吸附柱上。同时打开色谱柱下端活塞，保持适当流速，收集洗脱液，也可用自动收集器收集。洗脱时，一般先选用洗脱能力弱的洗脱剂洗脱，逐步增加洗脱能力。收集洗脱液时，如果被分离的各组分有颜色，可按不同的色带分别收集；如果无色，采用等量逐份收集洗脱液，若各组分的结构相似，每份收集的尽量要小，反之要大些。每份洗脱液采用薄层色谱或纸色谱定性鉴定，根据分析结果，成分相同（斑点相同）的洗脱液合并，回收溶剂，可得一单体成分。如仍为几个成分的混合物，可再用柱色谱或其他方法进一步分离。