3.4 酶的分离纯化及活力测定
蛋白质的结构研究和酶的催化活性研究是蛋白质化学的重要内容，酶的研究随着蛋白质分离纯化技术的发展而不断深入，酶的分离纯化是酶学研究的基础，其目的是获取纯净的酶，便于研究酶的结构、性质和催化特征。
3.4.1 酶的分离纯化
根据酶在生物细胞的分布情况，可分为胞内酶和胞外酶两类。胞内酶是在细胞内合成并在细胞内发生催化作用，它们需要破碎细胞后才能释放出来，因此提取效果与细胞破碎程度有密切关系。胞外酶是在细胞内产生、分泌到细胞外参与作用的一类酶，水解酶居多，它们通常比胞内酶更容易分离纯化。
大多数酶是蛋白质，所以常用的蛋白质分离纯化方法都可用于酶的分离纯化。为了达到最终获得高纯度酶的目的，分离纯化前要对目标酶及其杂蛋白的理化性质，如溶解度、带电性质、分子大小等特性进行全面了解，选用不同的分离提纯技术。一般情况下，通过超滤、透析、盐溶/盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、硫酸铵分级沉淀、选择性热变性等分离方法进行酶的粗分离，再选择凝胶色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、吸附色谱法、疏水色谱法、高效液相色谱法以及电泳技术等进行纯化。为得到酶的纯品，有时可将上述方法中的几种联合使用。相关分离纯化方法详见“2.7蛋白质的分离与纯化”，这里主要讲述有关酶分离纯化中要注意的事项。
①选择含酶量丰富的新鲜生物原料。动物或植物不同的器官或组织酶的含量相差可达上万倍，近年来多采用微生物作原材料，常采用水或低盐缓冲液得到酶的粗提液。
②温度是影响酶分离纯化的重要因素。选取材料后应当尽快进行分离，否则应在-70～-20℃暂时保存。分离纯化操作通常在低温0～4℃下进行，使用有机溶剂提取时更要严格控制温度，一般在-20～-15℃下进行，并且分批添加有机溶剂。
③大多数酶在过酸或过碱条件下不稳定。pH一般不应超出酶的适应范围，通常pH<4或pH>10时酶易失活；除非等电点沉降，否则提取液的pH远离酶的等电点更利于提纯，如酸性蛋白质可用碱性溶液分离。
④在过滤和搅拌操作中，防止泡沫产生，避免酶在溶液表面形成薄膜而变性。
⑤在提取液中加入保护剂，如少量的金属螯合剂（EDTA、EGTA等）可避免重金属离子破坏酶活性；加入巯基试剂（巯基乙醇、二硫苏糖醇等）可防止含巯基酶的巯基被氧化。
⑥酶分离纯化全程都要对酶活进行跟踪检测，保证每个步骤所采用的分离方法和操作条件都有效和恰当。
⑦酶的纯度可以采用高效液相色谱、电泳、超离心、免疫学等方法检验。
3.4.2 酶的活性测定
在研究酶动力学、酶性质、酶分离纯化以及酶应用中都需要了解酶的活性。酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，是其催化能力的一种表征，酶活力越高表明其催化反应速率越快，因此可以用一定条件下酶促反应的速率来表示，即单位时间、单位体积内底物的减少量或产物的增加量，或单位时间内底物或产物浓度的变化（浓度/时间）。酶促反应初始时往往加入过量的底物，反应中底物变化程度相对较小，不容易准确测定，所以通常以测定产物增加量更为准确。通过酶促反应的产物生成量与反应时间作图，可以得到一条反应曲线，其中某一点的斜率即表示相应时间的反应速率。通常情况下，酶活力采用酶促反应的初始速率表达。
测定酶活力的常用方法有：
①分光光度法（spectrophotometry）：利用产物或底物在紫外或可见光范围内的光吸收变化，测定反应进程。该方法简便、省时，是测定酶活力的常用方法。如依据NADH/NADPH在340nm处有吸收光谱，根据其吸光度的变化检测氧化还原反应中脱氢酶的活性。
②荧光法（fluorometry）：根据产物或底物的荧光性质不同进行测定的一种方法。荧光法较分光光度法灵敏，但易受其他物质干扰，如蛋白质可吸收或发射荧光，在紫外区尤为明显，所以尽量选择在可见光区进行荧光检测。
此外，量气法、pH值测定法、氧和过氧化氢极谱法、旋光法和量热法等也常用于酶活力测定。
3.4.3 酶活表征
①酶活力单位（activity unit，U）是表示酶量的指标。
1961年国际酶学委员会规定：在特定条件（一定温度、pH、底物浓度、离子强度等）下，1min内催化1μmol底物转化成产物所需要的酶量，称为一个酶活力单位。国际单位用U或IU表示，1U=1μmol/min。
1972年国际酶学委员会又提出一个新规定：在最适条件下，1s催化1mol底物转化的酶量为1Katal（简写为Kat），即1Kat=1mol/s。
两个单位之间的换算关系是：1U=1/60μKat=16.7nKat，或1Kat=6×107U。
②酶的比活力（specific activity）是表示酶纯度的指标。
国际酶学委员会规定：每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位（U/mg）；也可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有的酶活力单位来表示（U/g或U/mL）。酶的比活力越大，表示它的纯度越高。酶的比活力在酶学研究和分离纯化中常常用到。