第三章 免疫技术

第一节 流式细胞术

【概述】

流式细胞术（f1ow cytometry, FCM）是一种集细胞生物化学技术、单克隆抗体技术、激光技术、流体力学、电子技术、计算机技术、分子生物学、临床医学等理论于一体的现代分析技术。能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态进行定性或定量检测，并在必要时进行分类收集的多参数检测细胞分析技术。

【适应证】

（一）血液病的诊断：阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）诊断、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分析。

（二）在器官移植中的应用：人类同种异体器官移植、造血干细胞移植。

（三）在免疫学中的应用：淋巴细胞亚群测定、细胞因子测定、HLA-B27分析、淋巴细胞功能、树突状细胞研究、造血干细胞研究。

（四）在肿瘤诊断和治疗中的应用：细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究、肿瘤相关基因表达研究、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究等。

【操作方法】

（一）打开电源，对系统进行预热。

（二）打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度，开启光源冷却系统。

（三）在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统。

（四）利用标准校准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0°和90°散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小。

（五）选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品。同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程。

（六）样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统。

（七）结果分析、报告。

【注意事项】

（一）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露在较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作。另外还要注意磁屏蔽。

（二）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开。使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常。

（三）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒。

（四）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等。

（五）特别强调每次测量都需要对照。

（刘 瑜 万楚成）

第二节 骨髓移植术

【概述】

骨髓移植术（bone marrow transp1antation, BMT）是经大剂量放化疗或其他免疫抑制剂预处理，清除受体体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体骨髓造血干细胞移植给受体，使受体重建正常造血和免疫功能，而达到治疗疾病的一种治疗手段。包括自体骨髓移植和异体骨髓移植。目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病、自身免疫性疾病和某些实体瘤治疗，并获得了较好的疗效。

【适应证】

骨髓移植的适应证主要是对化疗或放疗敏感的血液病及其他疾病，具体如下：

（一）血液系统恶性肿瘤：各种急性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、恶性组织细胞病等。

（二）血液系统非恶性肿瘤：再生障碍性贫血、范可尼贫血、镰状细胞贫血、骨髓纤维化、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、海洋性贫血等。

（三）其他实体瘤：乳腺癌、卵巢癌、辜丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌等。

（四）免疫系统疾病：重症联合免疫缺陷症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、难治性免疫性血小板减少性紫癜、严重自身免疫性疾病。

（五）急性放射病。

【禁忌证】

（一）原发病对化疗和（或）放疗不敏感。

（二）异体骨髓移植没有供体。

【操作方法】

（一）异体骨髓移植

1．预处理：是指移植前对患者进行的大剂量化疗和（或）放疗，这种治疗称为预处理。预处理的目的是清除患者体内的包括肿瘤细胞在内的异常细胞。化疗的方式和剂量，以及是否需要行放疗等，主要取决于患者的基础疾病和移植的种类。

（1）受者提前1周进行药浴后住进无菌层流病房。

（2）同家属及单位负责人沟通，手术签字。

（3）进消毒饮食（饮食经高压消毒后食用，水果用洗必泰浸泡后洗净去皮食用）。

（4）中心静脉插管。

（5）按照预处理方案进行大剂量化疗或放疗。

2．骨髓采集：在层流无菌手术室内对供者进行骨髓采集，一般应用硬膜外麻醉，采髓部位以髂后上棘为佳，也可在髂前上棘、胸骨、棘突等部位，儿童则需加胫骨处，以多点和不同深度采髓。移植骨髓所需的有核细胞数应按受（患）者体重和供体来源而定，采集的骨髓经过不锈钢网过滤后注射至血袋或采集瓶中，用肝素抗凝以防骨髓血凝集。

3．骨髓回输：在预处理结束24h后从受者中心静脉插管内输入供者的骨髓。

（二）自体骨髓移植

1．预处理：方案同异体骨髓移植，但时间是在骨髓采集之后进行。

2．骨髓采集：在层流无菌手术室内对患者进行骨髓采集，方法同异体骨髓移植。

3．自体骨髓的保存：将采集的骨髓在4℃条件下保存72h后回输，不影响移植成活效率，也可应用10%二甲亚砜作为骨髓冷冻保护剂，使骨髓保存于-196℃的液氮中。

4．自体骨髓的净化：净化方法分为负净化和正净化两大类。负净化也称阴性选择，是将肿瘤细胞从移植物中清除掉，从而获得干净的移植物。正净化也称阳性选择：将正常造血干细胞从移植物中分离纯化。具体方法有：①物理学方法。②药物净化法。③免疫学方法。④细胞培养法。

5．自体骨髓的回输：在预处理结束24h后，取出低温保存的经过净化的自体骨髓，回输方法同异体骨髓移植。

【并发症】

（一）早期并发症（<100d）

1．与预处理相关：黏膜炎、出血性膀胱炎、肝静脉阻塞病、间质性肺炎等。自体骨髓移植和异体骨髓移植均可发生。

2．感染：是移植相关死亡的主要原因，可以发生于移植的整个过程及移植后。常见感染微生物包括细菌、病毒及真菌，多为混合感染。异体骨髓移植比自体骨髓移植发生率高。

3．植入失败：多见于异体骨髓移植。

4．植入综合征：是指骨髓移植后中性粒细胞恢复过程中，出现发热、红色皮疹、非心源性肺水肿等。

5．急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因骨髓移植移植相关死亡的主要原因，自体骨髓移植无GVHD。

（二）晚期并发症（>100d）

1．慢性移植物抗宿主病（cGVHD）：只见于异基因骨髓移植。

2．甲状腺机能减退、生长发育障碍、不育、性腺机能减退等，异体骨髓移植明显多见。

3．白内障：主要是含有TBI的预处理方案的患者。

4．感染：病毒、细菌、结核等。

5．继发肿瘤：常见的有移植后淋巴增殖性疾病、骨髓增生异常综合征、白血病和实体瘤。

【注意事项】

（一）移植前要做好相应的准备工作，包括体检及相关实验室检查。

（二）移植过程中注意无菌操作和护理。

（三）移植后定期复查。

（万楚成 张巍）

第三节 外周血造血干细胞移植术

【概述】

外周血造血干细胞移植（periphera1 b1ood stem ce11 transp1antation, PBSCT）是经大剂量放化疗或其他免疫抑制剂预处理，清除受体体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞，阻断疾病的发病机制，然后把自体或异体外周血造血干细胞移植给受体，重建其正常造血功能和免疫功能，而达到治疗疾病的一种治疗手段。是近年来发展迅速的一项治疗技术，目前广泛应用于恶性血液病、非恶性难治性血液病、自身免疫性疾病、遗传性疾病和某些实体瘤治疗。

【适应证】

同骨髓移植。

【禁忌证】

（一）原发病对化疗和（或）放疗不敏感。

（二）异体外周血干细胞移植没有供体。

【操作方法】

（一）外周血干细胞的动员：在正常生理条件下，外周血干细胞数量很少，不能满足移植数量的需要。白血病或恶性淋巴瘤晚期等血液系恶性肿瘤作自身的PBSCT时，以选择抗肿瘤化疗药物作为动员剂量。而对于异基因外周血干细胞移植供者宜选用GM-CSF或G-CSF。

（二）外周血干细胞的采集：在化疗动员结束后2～3周，外周血白细胞计数升至（1.0～2.0）×109/L时。应用血细胞分离机如CS3000, COM·TEC等，用干细胞采集程序分离1～4次，直至采集到造血功能重建所需的细胞数。

（三）外周血干细胞净化：自体外周血干细胞移植需要在体外净化，具体方法同自体骨髓移植。

（四）外周血干细胞体外扩增：为了确保PBSCT后造血重建，CD34+细胞不应低于2.5×106/kg。因此，可采用部分CD34+细胞进行体外扩增。利用造血干细胞的高度增殖能力和多向分化潜能，以及各种造血生长因子和造血基质细胞的调控作用，可使来自于外周血的 CD34+细胞在SCF、IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、EPO和PIXY321等细胞因子不同组合的刺激下得以大量扩增。

（五）外周血干细胞的冻存：通常每次经血细胞分离机分离后所得的细胞悬液约50mL，可加入等量20%二甲基亚砜（DMSO）和RDMI1640保养液，使DMSO的最终浓度调整至10%。然后采用程序降温法降温，置于-196℃液氮中贮存。

（六）外周血干细胞的输注：输注前将冻存的外周血干细胞悬液立即置入40～42℃水浴中3min内迅速解冻，然后低温离心去除含DMSO上清液。加等量RPMI1640保养液稀释，每次输注400～600mL，在1h内输注完毕。

【并发症】

异体外周血造血干细胞移植的慢性移植物抗宿主病比异体骨髓移植更多见，其余并发症同骨髓移植。

【注意事项】

（一）移植前要做好相应的准备工作，包括体检及相关实验室检查。

（二）移植过程中注意无菌操作和护理。

（三）移植后定期复查。

（万楚成 宋斌）

第四节 染色体检测术

【概述】

常用的染色体检查技术有四种类型，即G带、R带、C带和Q带。其中G带和R带在国内应用最广泛。将制好的标本玻片用胰酶消化后，再用Giemsa染色，所显示的明暗相间的带为G带。如果先将染色体制片，经80～90℃高温处理后，再用Giemsa染色，所显示的明暗相间的带为R带。R带显带法可使染色体末端着色特别深，对测定染色体长度，末端区域结构改变，研究染色体缺失、重排非常有利。

【适应证】

（一）用于白血病的诊断和鉴别诊断、分型，监测急性白血病缓解或复发。

（二）慢性粒细胞白血病分期。

（三）验证骨髓移植是否成功。

（四）作为判断恶性血液病的独立预后指标和残留病灶的检测。

（五）作为肿瘤性质的鉴别，原因不明的不孕症、多发性流产和畸胎等夫妇及大龄妇女产前检查。

【检查方法】

采外周血或骨髓液3～5mL注入含培养基的无菌肝素抗凝青霉素小瓶中，将细胞培养24～72h，在收获前1h加入秋水仙碱，以阻止细胞分裂，用0.075M的低渗氯化钾溶液低渗30～40min，再用1∶3的冰醋酸与甲醇混合液固定，然后进行滴片、烤片，将制好的标本玻片用胰酶消化后，再用Giemsa染色，最后用显微镜观察并借助染色体核型分析系统发出报告。

【注意事项】

（一）快速抽取骨髓液直接注入染色体专用小瓶中，将小瓶上下颠倒5～6次即可，避免剧烈摇晃。注入骨髓液时切忌将染色体专用小瓶的瓶塞打开。

（二）抽取骨髓液避免产生凝块，若有凝块需重新抽取。

（三）个别患者需要外周血24h培养者，外周血中幼稚细胞＞30%方可送检。

（张霞）