3 人参中糖类分析方法
人参中糖类成分是人参的主要功能因子及有效成分，发挥着不可小觑的作用。有关多糖的分析方法有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、比色定量法、纸色谱法、离子交换色谱法、酶法、原子吸收法、HPLC法、DNS（还原法）、磷钼比色法等。本书采用DNS（还原法）对人参中总糖、人参还原糖进行了分析；采用分光光度法分析了人参多糖及糖醛酸；采用HPLC-DAD法分析了人参单糖。
3.1 人参总糖的分析方法
3.1.1 材料与仪器
3.1.1.1 人参
详见附录。
3.1.1.2 仪器
98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司），GF-254 型层析硅胶板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司），721型分光光度计（上海光学仪器厂）。
3.1.1.3 试剂
D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205）；3,5-二硝基水杨酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；苯酚、酒石酸钾钠（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；亚硫酸钠（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）；碘（分析纯，西陇化工股份有限公司）；碘化钾（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；氢氧化钠（分析纯，北京化工厂）；水为蒸馏水。
3.1.2 实验方法与结果
3.1.2.1 人参总糖提取
取干燥人参根粉末（过60目筛）约0.25g，精密称定，平行称取2份。将样品置于50mL具塞锥形瓶中，加入7.5mL蒸馏水和5mL 6mol/L的HCl溶液，混匀，置于100℃沸水浴中加热，使其水解完全，得水解液。取1滴水解液，置于白瓷板上，用碘-碘化钾试剂检查，至水解液不显蓝色，证明水解完全。冷却后用NaOH溶液中和至中性，滤过，离心，上清液用蒸馏水定容至50mL，混合均匀，即得。
3.1.2.2 总糖含量测定
（1）对照品溶液制备
D-无水葡萄糖对照品溶液：取干燥至恒定质量的D-无水葡萄糖适量，精密称定，用蒸馏水配制成1.04mg/mL的葡萄糖对照品溶液，即得。
（2）DNS显色剂的制备
将3.15g 3,5-二硝基水杨酸和131mL 2mol/L氢氧化钠加到250mL含有92.5g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入2.5g苯酚和2.5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至500mL，贮存于棕色瓶中，放置1周后使用。
（3）碘-碘化钾试剂的制备
依《中国药典》（2010年版）附录ⅩⅤB，取碘0.5g与碘化钾1.5g，加蒸馏水25mL使其溶解，即得。
（4）标准曲线的绘制
精密量取葡萄糖对照品溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL于10mL比色管中，补足蒸馏水至3mL，充分混合后每管加入0.75mL DNS溶液，混合均匀，在沸水浴中加热5min，流水冷却20min，放至室温，用蒸馏水定容至10mL，混合均匀，用分光光度计于540nm波长处测定吸光度。以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，见图3.1。得回归方程为y=0.7734x-0.0356，R=0.9976。结果表明，葡萄糖的质量浓度在0.208～1.456mg范围内，与吸光度呈良好的线性关系，结果见表3.1。
图3.1 吸光度-葡萄糖含量标准曲线
Fig 3.1 The calibration curve of absorbance-glucose levels
表3.1 标准品吸光度值
Tab 3.1 The absorbance of standard substance
（5）供试品总糖含量测定
精密量取供试品溶液0.2mL，照（4）项下的方法，自“补足蒸馏水至3mL”起依法操作，测定吸光度，从标准曲线上计算得供试品总糖含量，样品总糖含量按式（3.1）计算，即得。供试品1及供试品2的总糖含量，取平均值，即为样品中总糖的含量。
式中 M——样品质量，g；
C——吸光度（A）对应的样品中总糖的质量浓度，mg/mL；
V——定容体积；mL。
3.2 人参多糖的含量测定
3.2.1 材料与仪器
3.2.1.1 人参
详见附录。
3.2.1.2 仪器
98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司），GF-254型层析硅胶板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司），721型分光光度计（上海光学仪器厂），TGL-16aR型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。
3.2.1.3 试剂
D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205）；苯酚（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚（分析纯，北京化工厂）；水为蒸馏水。
3.2.2 实验方法与结果
3.2.2.1 人参多糖提取
取干燥人参根粉末（过60目筛）约10g，精密称定，每个样品称取2份，作为平行样。将样品置于500mL圆底烧瓶中，加入20倍量水，于100℃水浴中提取3h，过滤。滤渣再加20倍量水提取，提取3次，合并滤液，滤液减压浓缩，加95%乙醇调至醇浓度为75%，醇沉过夜，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得粗多糖，称定质量。
3.2.2.2 人参多糖含量测定
（1）对照品溶液制备
D-无水葡萄糖对照品溶液：取干燥至恒定质量的D-无水葡萄糖适量，精密称定，用蒸馏水配制成100μg/mL的葡萄糖对照品溶液，即得。
（2）供试品溶液的制备
取干燥粗多糖适量，精密称定，用蒸馏水配制成100μg/mL的贮备液，备用。
（3）标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液0、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL于10mL试管中，补足蒸馏水至1mL，加入6%苯酚溶液1mL摇匀，再加入浓硫酸5mL摇匀，在沸水浴中加热15min，再置于冰水浴中10min，室温放置15min，用紫外分光光度计于490nm波长处测定吸光度。以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，见图3.2。得回归方程为y=9.0571x-0.0140（R=0.9942，n=7）。结果表明，葡萄糖的质量浓度在0.02～0.08mg范围内，与吸光度呈良好的线性关系，见表3.2。
图3.2 吸光度-葡萄糖含量标准曲线
Fig 3.2 The calibration curve of absorbance-glucose levels
表3.2 标准品吸光度值
Tab 3.2 The absorbance of standard substance
（4）人参多糖供试品测定及结果
精密量取供试品溶液0.5mL，照（3）项下的方法，自“补足蒸馏水至1mL”起依法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中多糖含量，样品多糖含量按式（3.2）计算，即得。供试品1及供试品2的多糖含量，取平均值，即为样品中多糖的含量。
式中 m1——粗多糖取样量，g；
m2——提取所得粗多糖质量，g；
M——样品质量，g；
C——吸光度（A）对应的样品中多糖的质量浓度，mg/mL；
V——样品定容体积，mL。
3.3 人参还原糖的含量测定
3.3.1 材料与仪器
3.3.1.1 人参
详见附录。
3.3.1.2 仪器
98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司），GF-254型层析硅胶板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司），721型分光光度计（上海光学仪器厂），FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。
3.3.1.3 试剂
D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205）；3,5-二硝基水杨酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；苯酚、酒石酸钾钠（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；亚硫酸钠（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）；水为蒸馏水。
3.3.2 实验方法与结果
3.3.2.1 人参还原糖提取
取干燥人参根粉末（过60目筛）约0.25g，精密称定，每个样品称取2份，作为平行样。将样品置于50mL具塞锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，在50℃恒温水浴中加热30min，过滤。滤渣再加入15mL蒸馏水，在50℃恒温水浴中加热30min，过滤。合并滤液，离心，上清液用蒸馏水定容至50mL，混合均匀，即得。
3.3.2.2 人参还原糖含量测定及结果
（1）对照品溶液制备
D-无水葡萄糖对照品溶液：取干燥至恒定质量的D-无水葡萄糖适量，精密称定，用蒸馏水配制成1.04mg/mL的葡萄糖对照品溶液，即得。
（2）DNS显色剂的制备
将3.15g 3,5-二硝基水杨酸和131mL 2mol/L氢氧化钠加到250mL含有92.5g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加2.5g苯酚和2.5g亚硫酸钠，搅拌均匀，放至室温后加水定容至500mL，贮存于棕色瓶中，放置一周后使用。
（3）标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL于10mL比色管中，补足蒸馏水至3mL，充分混合后每管加入0.75mL DNS溶液，混合均匀，在沸水浴中加热5min，流水冷却20min，放至室温后用蒸馏水定容至10mL，混合均匀，用紫外分光光度计于540nm波长处测定吸光度。以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，见图3.3。得回归方程为y=0.7013x-0.0952，R=0.9998。结果表明，葡萄糖的含量在0.208～1.456mg范围内线性关系良好，见表3.3。
图3.3 吸光度-葡萄糖含量标准曲线
Fig 3.3 The calibration curve of absorbance-glucose levels
表3.3 标准品吸光度值
Tab 3.3 The absorbance of standard substance
（4）人参供试品中还原糖含量测定及结果
精密量取供试品溶液0.8mL，照标准曲线绘制项下的方法，自“补足蒸馏水至3mL”起依法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中还原糖含量，样品还原糖含量按式（3.3）计算，即得。供试品1及供试品2的还原糖含量，取平均值，即为样品中还原糖的含量。
式中 M——样品质量，g；
C——吸光度（A）对应的样品中还原糖的质量浓度，mg/mL；
V——定容体积；mL。
3.4 人参糖醛酸的含量测定
3.4.1 材料与仪器
3.4.1.1 人参
详见附录。
3.4.1.2 仪器
98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司），GF-254 型层析硅胶板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司），721型分光光度计（上海光学仪器厂），TGL-16aR型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。
3.4.1.3 试剂
D-半乳糖醛酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111646-200301）；间羟基联苯（阿拉丁）；无水四硼酸钠（阿拉丁）；苯酚（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚（分析纯，北京化工厂）；水为蒸馏水。
3.4.2 实验方法与结果
3.4.2.1 人参糖醛酸的提取
取干燥人参根粉末（过60目筛）约10g，精密称定，每个样品称取2份，作为平行样。将样品置于500mL圆底烧瓶中，加入20倍量水，于100℃水浴中提取3h，过滤。滤渣再加20倍量水提取，提取3次，合并滤液，滤液减压浓缩，加95%乙醇调至醇浓度为75%，醇沉过夜，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得粗多糖，称定质量。
3.4.2.2 糖醛酸含量测定及结果
（1）对照品溶液制备
D-半乳糖醛酸对照品溶液：取干燥至恒定质量的D-半乳糖醛酸适量，精密称定，用蒸馏水配制成100μg/mL的半乳糖醛酸对照品溶液，即得。
（2）供试品溶液的制备
取干燥粗多糖适量，精密称定，用蒸馏水配制成100μg/mL的贮备液，备用。
（3）标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液0、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.35mL、0.45mL于10mL试管中，补足蒸馏水至1mL，于冰水浴中加入四硼酸钠-浓硫酸溶液6mL，振荡均匀，沸水浴煮沸6min。冷却至室温后，加入间羟基联苯80μL，摇匀，室温放置30min，在525nm处测定吸光度。以半乳糖醛酸含量（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，见图3.4。得回归方程为y=15.1130x+0.0324，R=0.9981。结果表明，半乳糖醛酸在0.006～0.056mg范围内线性关系良好，见表3.4。
图3.4 吸光度-半乳糖醛酸含量标准曲线
Fig 3.4 The calibration curve of absorbance- galactose acid levels
表3.4 标准品吸光度值
Tab 3.4 The absorbance of standard substance
（4）人参中糖醛酸测定及结果
精密量取供试品溶液0.5mL，照（3）项下的方法，自“补足蒸馏水至1mL”起依法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中糖醛酸含量，样品糖醛酸含量按式（3.4）计算，即得。供试品1及供试品2的糖醛酸含量，取平均值，即得。
式中 m1——粗多糖取样量，g；
m2——提取所得粗多糖质量，g；
M——样品质量，g；
C——吸光度（A）对应的样品中多糖的质量浓度，mg/mL；
V——样品定容体积，mL。
3.5 人参中单糖的含量测定
3.5.1 材料与仪器
3.5.1.1 人参
详见附录。
3.5.1.2 仪器
1525型高效液相色谱仪（Waters），附有PDA紫外检测器（Waters 2998 Photodiode Array Detector）及Impower 3色谱数据处理系统（Waters）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司）；旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司）；FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司）；721型分光光度计（上海光学仪器厂）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。
3.5.1.3 试剂
单糖对照品木糖（Xyl）、半乳糖醛酸（galacturonic acid）、葡萄糖（Glu）购自中国药品生物制品检定所；阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gala）、岩藻糖（Fuc）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）购自北京盈泽纳新化工技术研究院。1-苯基-3-甲基-5-吡唑喹酮（PMP）、三氟乙酸（TFA）、三氯甲烷、氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为去离子水。
3.5.2 实验方法
3.5.2.1 混合对照品溶液的制备
精密称取8种单糖标准品各2mg，置于同一试管中，加入0.3mol/L的NaOH溶液200μL及0.5mol/L的PMP甲醇溶液500μL，70℃水浴中反应100min，冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸溶液500μL中和。加水至2mL，加入2mL三氟乙酸以除去未反应的PMP，重复三次。将水相用0.45μm的针式过滤器过滤，即得混合对照品溶液。置冰箱中保存备用。
3.5.2.2 人参单糖供试品的制备
精密称取人参粗多糖10mg，加入2mol/mL的三氟乙酸溶液2mL，氮气封管，于100℃水浴中水解6h。取水解液800μL，氮气吹干，吹的同时反复加入甲醇以除净未反应的三氟乙酸，残留物依照3.5.2.1项下“加入0.3mol/L的NaOH溶液”开始进行供试品衍生化处理，即得供试品溶液。
3.5.2.3 色谱条件
流动相为乙腈∶0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.7）=5∶95，流速1mL/min。色谱柱为Spursil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温30℃，检测器波长250nm。精密吸取对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，得对照品HPLC色谱图。分别见图3.5和表3.5。
图3.5 8种单糖标准品HPLC图
Fig 3.5 HPLC chromatogram of eight monosaccharide standard substances
A—半乳糖醛酸；B—Gala；C—Glu；D—Ara；E—Xyl；F—Man；G—Fuc；H—Rha
表3.5 人参单糖标准品溶液的浓度及HPLC色谱图保留时间
Tab 3.5 Eight kinds of monosaccharide reference substances and the retention time
3.5.2.4 方法学考察
（1）线性关系
精密吸取对照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、12μL、16μL、20μL，进样，记录色谱图。以对照品的量（μg）为横坐标（x），以对照品的峰面积为纵坐标（y），进行线性回归分析，得到回归方程，见表3.6。
表3.6 8种单糖线性回归方程和相关系数
Tab 3.6 Regression equations with correlation coefficients（R）of eight monosaccharide standard substances
（2）精密度、重复性及稳定性考察
精密吸取混合对照品溶液20μL，连续进样6次，各组分色谱峰的保留时间波动在0.3min内，峰面积的RSD（相对标准偏差）为0.94%～2.56%。表明仪器的精密度良好。
取同一人参多糖样品，按3.5.2.2项下平行制备6份，分别进样20μL，各组分色谱峰峰面积的RSD为1.07%～2.82%，说明实验重现性良好。
取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，计算得各组分色谱峰峰面积的RSD为1.65%～4.87%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
（3）加样回收率考察
取同一人参多糖样品10mg，共3份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，再加一定量的木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖及鼠李糖对照品，按照3.5.2.2项下处理样品，取20μL进样，记录色谱图，根据峰面积计算含量，其回收率范围为94.8%～105.6%，RSD范围为1.54%～4.91%，加样回收率良好。
3.5.2.5 人参供试品水解后单糖含量测定及结果
取人参供试品溶液20μL，进样，记录色谱图。对照单糖峰面积-含量线性回归方程，计算出人参样品中8种单糖的含量。研究结果表明，人参多糖水解物的PMP衍生物中存在7个单糖色谱峰，分别为木糖（Xyl）、半乳糖醛酸（Galacturonic acid）、葡萄糖（Glu）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gala）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha），单糖种类及所占比例及其物质的量浓度比，见下篇。