2　人参中蛋白质分析方法

蛋白质是人参的主要营养成分及功能因子，蛋白质的分析方法有微量凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）、水杨酸比色法、紫外分光光度法等。本书首次采用分光光度法对人参中蛋白质进行了分析。

2.1　材料与仪器

2.1.1　人参

见附录。

2.1.2　仪器

721型分光光度计（上海光学仪器厂），98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），R201D型恒温水浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司），旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司），GF-254型层析硅胶板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），FA1104N型电子分析天平（上海菁华科技仪器有限公司），FW177型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

2.1.3　试剂

牛血清蛋白；考马斯亮蓝G250（中国惠世生化试剂有限公司）；聚乙二醇6000（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；Tris（201311120256）；盐酸（分析纯，北京化工厂）；水为蒸馏水。

2.2　方法与结果

2.2.1　提取方法

取干燥人参根粉末（过60目筛）约5g，精密称定，每个样品称取2份，作为平行样。将样品置于50mL具塞锥形瓶中，加入15倍量的 10mmol/L pH 7.4 Tris-HCl（0.15mol/L NaCl）缓冲液，搅拌均匀，在4℃下浸提20h。5000r/min低温离心30min，留上清液，向沉淀中加入15倍量的10mmol/L pH 7.4 Tris-HCl（0.15mol/L NaCl）缓冲液进行二次浸提，5000r/min低温离心30min，将两次离心所得上清液合并。

向蛋白质粗提液中加入聚乙二醇6000，至终浓度为20%，搅拌均匀。4℃下静置过夜，5000r/min低温离心30min，弃去上清液，用蒸馏水将沉淀搅起，定容至50mL。

2.2.2　蛋白质含量测定

2.2.2.1　对照品溶液制备

牛血清蛋白对照品溶液：取牛血清蛋白对照品适量，精密称定，用蒸馏水配制成1.04mg/mL的牛血清蛋白对照品溶液，即得。

2.2.2.2　标准曲线的绘制

参考《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）（2010年版）附录ⅦM　蛋白质含量测定法第五法。

精密量取对照品溶液0、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.10mL、0.12mL、0.14mL于10mL试管中，补足蒸馏水至0.2mL，加考马斯亮蓝溶液5mL，立即混匀，在595nm波长处测定吸光度。以牛血清蛋白含量（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，见图2.1。得回归方程为y=5.9218x-0.0476（R=0.9977，n=7）。结果表明，牛血清蛋白的质量浓度在0.021～0.147mg范围内，与吸光度呈良好的线性关系。见表2.1。

2.2.2.3　测定法

精密量取供试品溶液0.2mL，照标准曲线绘制项下的方法，自“补足蒸馏水至0.2mL”起依法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中蛋白质的量，样品蛋白质含量按式（2.1）计算，即得。供试品1及供试品2的蛋白质含量，取平均值，即为样品中蛋白质的含量。

式中　m——样品质量，g；

　　　V——定容体积，mL；

　　　m′——吸光度（A）对应的样品中蛋白质的质量，mg；

　　　V′——测定吸光度时的取样体积，mL。