第二节　免疫学研究的发展现状

角膜移植手术是治疗各种中晚期角膜病变的重要治疗方法。尽管随着新技术、新材料的应用，角膜移植手术的成功率已经有了大幅提升，但在临床上由于各种免疫因素导致的角膜植片排异反应目前仍是导致移植失败的主要原因。对角膜免疫学的深入研究仍是当前提高角膜移植手术成功率的重要前提。免疫学研究认为，角膜植片的排斥需要三个过程：供体抗原的释放识别并被传输到淋巴组织、抗原被处理并产生特异性免疫细胞、机体通过细胞和体液免疫途径攻击移植片。

一、供体抗原的释放和排斥反应的启动

研究证实，HLA（人类白细胞抗原）抗原在角膜的上皮、基质和内皮层中均可表达，其中在角膜缘部的角膜上皮和角膜基质表达最明显。这些HLA抗原包括肽类抗原和非肽类抗原（脂类和糖类抗原）。此外，研究发现血型抗原在植片排斥中也起作用。

二、抗原提呈过程和淋巴系统

抗原提呈是引起免疫排斥的关键环节。正常角膜组织中并没有抗原提呈细胞（antigenpresenting cell，APC）的存在；角膜移植排斥的患者并不是全部出现新生血管，因此推断淋巴系统可能在角膜排斥反应的抗原提呈过程中具有重要作用。动物实验显示带角膜抗原的APC 主要聚集于同侧的颈部淋巴结中；切除动物双侧颈部淋巴结可以100%抑制角膜排斥发生，也可使92%高危角膜移植存活期延长，进一步印证了这种推断。

三、角膜排斥中的信号传导和共刺激途径

在角膜移植的急性排斥反应和加速性排斥反应中，CD4+T细胞能够最早识别带有外源性MHC 的供体角膜。识别并活化的CD4+T 细胞分泌细胞因子，进而激活CD8+T 细胞和B 细胞引起的免疫应答，最终将移植片排除。在这个过程中，T细胞抗原受体（TCR）先与APC 细胞表面的MHC 类分子结合形成复合体TCR/MHC 对抗原进行识别，进而通过信号的传递使CD4+T 淋巴细胞活化增殖并产生多种淋巴因子。在这些淋巴因子的作用下，CD8+T 淋巴细胞活化增殖并对角膜植片表现细胞毒性作用。实验已经证实，应用抗CD4单克隆抗体能够阻断TCR/MHC 复合体的形成，进而显著延长角膜植片的存活。

常见的T 淋巴细胞的活化过程，各级信号的传导和放大多数是通过TCR/CD4 复合体共刺激途径完成的。共刺激信号首先由细胞表面分子CD28 传导。CD28 分子有两个配体，分别是位于活化的APC 细胞表面的CD80 B7-1 和CD86 B7-2。APC与CD28的结合可使T细胞充分活化。若没有CD28 参与，则会使T细胞无反应或凋亡，进而抑制角膜排斥反应。此外，活化的T 淋巴表面表达的CTLA-4、CD152 分子也可以与CD80/CD86 结合，对T 淋巴细胞发出负反馈信号产生抑制作用，进而使角膜植片的存活时间延长。

除了TCR/CD4 复合体共刺激途径，研究发现CD154/CD40L复合体也能够引发共刺激途径。CD154表达于活化T 淋巴细胞表面，是TNF 家族成员，可与CD40 相结合。CD40 是TNF 受体家族成员，表达于包括APC 细胞的多种细胞表面。应用抗CD40L 的单克隆抗体阻断CD40/CD154 的相互作用也可使角膜植片存活时间延长。

四、ACAID与角膜免疫耐受

目前认为角膜的免疫赦免已经超出了角膜的无血管因素而更与前房有关，因此称之为前房相关性免疫偏离（anterior-chamber-associated immunedeviation 简称ACAID）。它主要表现为对抗原特异性的迟发性超敏反应的抑制、对补体结合抗体的抑制、对其他体液免疫的保留。ACAID 的发生与前房中的可溶性细胞成分有关。眼前节的正常结构及免疫微环境的存在是ACAID 的前提。在这个被称为“压制迟发型超敏（delayed type hypersensitivity简称DTH）反应”的过程中，CD4+T 细胞和CD1d 反应NKT 细胞均参与其中。

（一）CD4+T细胞在角膜免疫耐受中的作用

CD4+T 细胞受抗原刺激后可分化为Th1 与Th2 两个亚群，分别分泌不同的细胞因子。Th1 分泌IL-2、IFN-γ及TNF-β等，作用是介导引起角膜植片排斥的DTH；Th2 分泌IL-4、IL-10 及IL-13 等，作用是对Th1 细胞的作用进行调理和约束。

（二）CD1d反应NKT细胞在角膜免疫耐受中的作用

角膜植片的长期存活需要CD1d 反应NKT细胞的存在。CD1d 是表达于APC 细胞表面的单一形态的、非MHC 编码的、类MHC 类分子的抗原提呈分子，NKT 细胞是同时表达TCRαβ链和NK表面标致的淋巴细胞。只有与CD1d 分子结合的NKT 细胞才能诱发免疫耐受的出现，表现为角膜移植术后植片长期存活者的DTH丧失和免疫球蛋白结合补体的能力丧失。须经荧光素染色，再结合细菌、共聚焦显微镜检验综合分析。

五、免疫学在抗角膜移植排斥策略中的应用和展望

随着研究的深入，目前已经有多种免疫学和分子生物学新型治疗途径在抗角膜移植排斥的临床实际中应用。

（一）抗角膜移植排斥药物

目前应用于抗角膜移植排斥的药物主要有两大类：化学免疫抑制剂类药物和抗体类药物。

化学免疫抑制剂药物主要包括：①非特异性抗增殖类药物：代表药物为类固醇皮质激素；②抑制IL-2 生成的药物：包括他克莫司；③抑制生长因子传递的药物：代表药物雷帕霉素；④特异性抑制淋巴细胞增殖的药物：代表药物吗替麦考酚酯（mycophenolatemofetil）。

抗体类药物包括：①针对细胞因子及其受体的生物制剂：抗IL-2R 单克隆抗体、抗IFN-γ的单克隆抗体、TNF的拮抗剂；② 抗黏附分子的单克隆抗体；③阻断共刺激信号的单克隆抗体和融合蛋白：CTLA4Ig、抗CD154单克隆抗体。抗体类免疫抑制剂以特定的免疫细胞表面结构为作用靶向，具有高度特异性，但单克隆抗体也存在一些问题，如首剂的过敏反应，受体产生针对治疗性抗体的抗体药代动力学等问题。

（二）通过提高供受体组织相容性来减少或减轻角膜移植排斥

1.通过术前组织配型来减少角膜移植排斥

尽管在大器官移植之前通常要进行组织配型来预测和避免排斥反应的发生，不同的研究对角膜移植术前是否有必要进行MHC 配型仍存在争议。有研究发现术前进行了ABO抗原配型的角膜移植患者3 年后发生排斥的概率为16%，而未做ABO配型的排斥率为30%。还有研究发现当HLA与次要组织相容性抗原不匹配时，发生的角膜移植排斥明显增高。但也有研究认为，尽管HLA配型可降低免疫排斥反应，而相同的HLA配型并不能有效阻止角膜内皮细胞的慢性丧失。此外，临床实际中很难寻找到与供体HLA配型一致的受体。

2.通过降低供体移植物的抗原性来减少角膜移植排斥

理论上讲，如果能够降低MHC抗原的表达，就可以提高供受体的组织相容性，进而减少移植排斥。但目前所有研究均处于基础实验阶段。有研究将表达抗大鼠MHCⅠ类抗原分子抗体的基因转入大鼠皮肤上皮细胞，发现对MHCⅠ类抗原的表达产生了明显的抑制作用。另一项研究将表达受体MHCⅠ类抗原分子的基因转入供体细胞内，发现可以使其免于受体NK细胞的攻击。

3.基因治疗

在角膜上进行基因治疗时，可以在角膜移植前将经过修饰的目的基因通过病毒载体转染到角膜植片的内皮细胞，已达到表达目的基因、控制角膜免疫反应的目的。该技术尽管前景广阔，但目前均处于实验阶段，短期难以在临床上运用。此外，目的基因的获取及转染载体的安全性是仍是目前基因治疗技术需要解决的焦点性问题之一。

4.RNA干扰技术（RNAi）

RNA干扰技术是通过人工合成的小分子干扰RNA（siRNA）特异性地抑制、降解同源mRNA 序列，有效阻止相应蛋白质的表达。体外合成的siRNA 具有分子量小穿透力强的特点，其药代动力学特性与普通化学合成药物基本相同。动物研究已经证实，siRNA 可通过基因修饰下调移植物的内源性抗原达到抗移植排斥的目的。

5.计算机辅助药物设计技术（computer-assisted drug disgn, CADD）

通过CADD 设计出特殊构型的药物，使其可以在抗原的识别淋巴细胞的活化增殖过程中与细胞识别相关蛋白分子的某些结构相结合，进而阻断抗原识别信号的传递，以达到控制免疫过程的目的。已经有研究基于CD4分子的domain1 的DOCK3.5 结构筛选出了几种小分子非肽类有机化合药物，在体外实验中能抑制CD4分子与MHC分子结合形成复合体，具有良好的抗排斥作用。