第六章 共聚焦显微镜、交联技术及基因疗法的应用
第一节 共聚焦显微镜现状与应用前景
一、活体共聚焦显微镜的应用现状
活体角膜共聚焦显微镜检查（invivo confocal microscopy，IVCCM）是一种非侵入性的成像工具，能够对活体的眼表组织结构进行无创、实时动态和四维（三维加时间）观察，并可观察各层组织之间的相互关系。共聚焦显微镜的主要优点是能够通过光学切片从选定的深度获取图像。
IVCCM在过去几十年的临床工作中不断扩大应用范围，使眼表的许多感染性疾病、营养不良，甚至全身疾病的眼部特征均得到了广泛而深入的研究。一批具有重要临床指导意义的量化IVCCM参数，如细胞密度（上皮、角质形成细胞和内皮细胞）、基底神经丛密度、数量、长度、弯曲度和反射率以及前基质背散射等被眼科临床所接受和使用。通过这些研究使我们对眼表（尤其是角膜）的正常结构和异常表现有了更全面和深入的认识。
（一）共聚焦显微镜的工作原理
简而言之，共聚焦显微镜的基本原理是一个点光源聚焦在组织的一个点上，同时由在同一个平面的照相机成像，即“共聚焦”。这个过程将产生一个具有高分辨率但几乎肉眼无法看到的极小的物象。为了观察到这个物象，可以采用扫描的方法，即采用上千的同样细小的点光源照射小块组织，并将所形成的上千的极小物象重建，从而形成具有高分辨率的可视图像。由于角膜是透明的，白光和激光均可作为光源，并获得高分辨的活体组织像。其分辨率可达细胞水平，景深可达10μm，横向分辨率可达1μm，可视范围在300μm×220μm。
（二）活体角膜共聚焦显微镜设备的发展现状
活体角膜共聚焦显微镜设备分为可见光和激光两大类。激光共聚焦显微镜的主要优点是能够连续地从角膜产生薄层图像。采用可见光的共聚焦显微镜受到后散射的影响较小。因此，在检测结膜、边缘角膜和角膜缘的浅表异常时最好选用激光共聚焦显微镜。
（三）角膜的共聚焦显微镜表现
1.角膜上皮层
依据细胞形态的不同，角膜上皮又大致分为三层——表层细胞、翼状细胞和基底细胞。
表层细胞位于角膜上皮浅层，表层细胞呈多边形，直径40～50μm，厚约5μm。内有一小而明亮的圆形细胞核，核周有低反射率的暗环，周围环绕着较深色的细胞质，细胞边界清晰。表层细胞的细胞质反射率变化巨大，分别代表了细胞处于的不同的过渡阶段。
翼状细胞位于角膜上皮中层，形态和大小多变，典型的细胞直径为30～45μm。它们的特征是明亮的细胞边界和明亮的细胞核，内有很少有细胞器，通常看不到核仁。
基底细胞直径10～15μm，有均匀明亮的细胞边界和黑暗的细胞质团，很难看到细胞核。
研究显示，糖尿病患者的角膜上皮层的基底细胞密度降低，光散射指数（组织反射率的定量指标）增加，反映了糖尿病患者基底膜的异常形态表现。
2.前弹力层（Bowman膜）
共聚焦显微镜下，前弹力层呈均质灰色，内有散在的串珠状的基底神经纤维穿过。共聚焦显微镜已被用于检测神经纤维的分布密度，但无法检测出神经纤维的直径或串珠密度。研究显示，糖尿病患者前弹力层的角膜神经纤维形态学发生了显著的改变，可以作为躯体神经病变严重程度的一项评判指标。
3.角膜基质层
基质中的胶原纤维和间质形成灰色的无定形背景，角膜细胞直径5～30μm。在灰色背景中角膜细胞核为高亮度，前基质层中的角膜细胞核为豆状，后部基质层中的角膜细胞核为椭圆状。角膜细胞质和细胞壁在灰色背景中无法辨别。前部角膜基质层中可见到神经纤维，直径4～8μm。研究表明，糖尿病患者的角膜细胞数量没有显著改变，但基质神经明显增粗。
4.后弹力层（Descemet's膜）
后弹力层的共聚焦图像呈均质状，无细胞结构，年轻人该层较薄，随着年龄增加而变厚。
5.角膜内皮层
该层厚度4～6μm，内皮细胞为直径20μm的六边形，细胞核很小，细胞质明亮均匀，细胞边界黑暗。研究显示，糖尿病患者的角膜内皮层损伤随着病情程度和时间的增长而增加，2型和1型糖尿病患者角膜内皮细胞的平均细胞密度分别比同龄正常人降低了5%和11%。
（四）活体角膜共聚焦显微镜在角膜厚度测量中的研究进展
共聚焦成像技术最重要的进展之一是共聚焦显微镜的“穿透聚焦”技术，又称为Z扫描模式。该技术可以应用在角膜厚度的测量中。Z扫描轮廓曲线是通过以角膜测量深度为X轴，以该深度的图像亮度为Y轴绘制而成的。通过对高分辨率的图像进行分析，Z扫描轮廓曲线可以精确地反映出不同角膜层面之间的距离。研究显示，这种技术可靠性很高，有望今后在临床上广泛推广。
（五）活体角膜共聚焦显微镜在临床中的应用
因为角膜共聚焦显微镜是一种非侵入性的活体角膜成像技术，所以已被广泛用于研究许多角膜疾病。活体角膜共聚焦显微镜可以做形态学的定性描述，也可以做病损的定量检测，如检测角膜神经、内皮细胞的形态和密度等，并形成活体角膜三维动力学图像，因此可以用于角膜损伤或感染的病情评估、角膜变性或营养不良的诊断，以及各种角膜疾病治疗前后随访管理。目前已经用于Fuchs内皮营养不良、糖尿病、眼干燥症（包括干燥综合征）、圆锥角膜、屈光术后角膜神经再生、角膜接触镜适配戴等多种临床工作。角膜共聚焦显微镜最新的应用是将其作为评估各种周围神经病病情的参考检查，或将其作为区别角膜水肿和角膜植片排异的手段，或将其作为角膜内皮分解症（无炎症细胞参与的内皮细胞数减少）的诊断依据。各个角膜层面的各种细胞（包括免疫细胞等）密度参数也均可通过角膜共聚焦显微镜获得，更多的应用与开发有待使用者的不断研究和开发。
1.在感染性角膜炎方面的应用
角膜共聚焦显微镜在病理性角膜炎的病原微生物鉴别方面具有重要的临床意义，尤其是对棘阿米巴角膜炎、微孢子虫角膜炎、真菌性角膜炎、疱疹性角膜炎、接触镜相关细菌性角膜炎、结晶性角膜炎和混合细菌性角膜炎等的诊断具有重要价值。
2.在角膜营养不良方面的应用
角膜共聚焦显微镜已经被用于Fuchs内皮营养不良、后部多形性角膜营养不良、ICE综合征的诊断，也被用于各种前弹力层角膜营养不良的鉴别诊断。已有研究显示，角膜共聚焦显微镜对角膜细节的检测能力与病理学光镜检查相当。
3.在屈光手术和角膜伤口愈合方面的应用
角膜共聚焦显微镜可以用于各种角膜屈光手术后角膜细胞密度、上皮下沉积物、基质改变和神经再生情况的定性和定量检测。有研究显示，LASIK术后第1个月时角膜基质浅层神经的数量和密度下降了90%，术后6个月时这些神经开始恢复，术后6～12个月时仍不到术前值的一半，术后2～5年时完全恢复，而这些神经的垂直走向与术前没有变化；准分子激光上皮下角膜磨镶术（laser subepithelial keratomileusis，LASEK）术后角膜基质神经再生速度比LASIK快，术后6个月未恢复到手术前水平。角膜共聚焦显微镜还可以活体观察角膜细胞、微生物、炎症细胞、上皮细胞的细节结构，来用于评估角膜愈合程度、长期手术效果稳定性和屈光手术后的并发症。
4.在接触镜引起的角膜改变方面的应用
角膜共聚焦显微镜可以用于检测戴镜后角膜基质的慢性变化。研究发现，接触镜的物理性刺激会导致角膜细胞的畸形或凋亡，并释放侵袭性介质，导致角膜细胞的减少。一般认为，长期配戴接触镜会令角膜的敏感性下降，但多个角膜共聚焦显微镜研究显示，无论是长期戴镜还是短期戴镜，角膜中的神经纤维形态和分布均没有显著改变。还有一项研究显示，患有糖尿病的软性角膜接触镜配戴者的角膜内皮细胞的形态与没有糖尿病的配戴者之间没有明显差异。
5.在角膜微沉积物方面的应用
角膜共聚焦显微镜可以用于对各种角膜微沉积物的鉴别，包括Fabry病、Wilson病、高脂血症和长期角膜接触镜配戴引起的沉积物。也有研究将其用于检测胺碘酮副作用引起的角膜沉积物和屈光手术后角膜沉积物。
6.角膜神经形态学
角膜共聚焦显微镜可以用于检测角膜基底层神经丛的神经纤维分布，具体有以下几个参数：
（1）角膜神经纤维密度（corneal nerve fiber density, CNFD）：
即每平方毫米面积上的主要神经纤维数目的总和。
（2）角膜神经纤维长度（corneal nerve fiber length, CNFL）：
即每平方毫米面积上所有神经纤维和其分支的长度总和。
（3）角膜神经分支密度（corneal nerve branch density, CNBD）：
即每平方毫米面积上主要神经纤维上产生的分支数目的总和。
（4）角膜神经纤维曲度（corneal nerve fiber tortuosity, CNFTo）：
即用数学公式计算得到的神经纤维弯曲度，用来反映神经纤维方向的变异性。
角膜共聚焦显微镜可用于提示糖尿病神经病变的发生，预测和监测糖尿病神经病变的进展，还可以可用于评估临床干预措施的疗效。
二、应用前景
截至目前，角膜共聚焦显微镜仅限于在眼科研究中心和较大的眼科诊疗机构使用，尚没有在各级医院的眼科广泛推广应用。计算机辅助的图像分析算法可以提高角膜形态学参数的准确性和重复性，实时三维重建也将为定量分析角膜组织和细胞结构提供更好的技术手段。此外，绘制整个角膜的成像技术无疑将提供完整的量化参考数据，将有助于获得更全面的角膜损伤、修复和疗效数据，也将加深角膜损伤的基本致病机制以及对组织损伤的免疫反应的深入理解。总之，未来的角膜共聚焦显微镜将具有巨大的应用前景。